М.Г. ДОМШЛАК
Окончание. См. № 47/2004
Генетический мониторинг
В основе появления врожденных
дефектов часто лежат отдельные мутации, как
доминантные (короткопалость,
хондриодистрофическая карликовость и др.), так
и рецессивные (гемофилия, ихтиоз, детская
амавротическая идиотия). Во многих случаях
врожденные дефекты человека обязаны не
отдельной мутации, а комплексу мутаций генов. Это
так называемые многофакторные, или полигенные,
болезни. В результате расщепления признаков у
потомков во многих случаях многофакторные
болезни проявляются нерегулярно (такие,
например, как астма, диабет, подагра и др.).
Спонтанная частота мутаций отдельных
генов у человека в пересчете на один ген крайне
низка и составляет около 1ґ10–5, т.е. одна
мутация на 100 тыс. генов. Суммарно частота
доминантных мутаций в популяциях человека равна
1%, рецессивных – 0,25% и мутаций хромосом – 0,34%.
Доля людей с врожденными дефектами, которые
могут проявляться в разных возрастах, составляет
около 10,6%.
Существует прямая зависимость между
ростом интенсивности и числа факторов
загрязнения окружающей среды и ухудшением
эколого-генетической ситуации. Так, в конце
XIX в. по данным обследований, проведенных в
Астрахани и Санкт-Петербурге, за несколько лет
значительно увеличились частота врожденных
пороков, число спонтанных абортов (на 14,6% за 10 лет)
и частота рождения детей с синдромом Дауна (с 1,15
до 1,36% за 4 года).
Генетический груз
Антропогенное загрязнение среды
обитания, вызывающее токсический, мутагенный и
канцерогенный эффекты, в настоящее время
является главным фактором генетического
давления на популяцию человека.
В прошедшем столетии в библиотеке
мутагенной информации в Окриджской национальной
лаборатории было собрано более 60 тыс.
публикаций, посвященных анализу мутагенной
активности химических соединений. Генетическим
аспектам проблемы «Человек и биосфера» уделено
специальное внимание в программе ООН по
окружающей среде (ЮНЕП). В ней указано: «Меры по
сохранению, охране и защите природной биосферы
обеспечивают для человека постоянное
генетическое разнообразие и являются
единственной гарантией продолжения
существования самого человека» (цит. по
Н.П. Дубинину).
Вопросы охраны генетического здоровья
человека в условиях возрастающей загрязненности
окружающей среды находятся в центре внимания и
Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ).
По данным мировой науки и
международной медицинской статистики (доклад
комитета экспертов ВОЗ по генетике человека),
реальный генетический груз человеческой
популяции в 1980–1990 гг. составлял 7% и включал
в себя:
– 0,5–1% – доля новорожденных с
хромосомными болезнями, вызванными геномными и
хромосомными мутациями;
– 0,5–1% – дети с заболеваниями или
аномалиями, детерминированными мутациями генов;
– более 2,5% – дети с врожденными
генетически обусловленными пороками развития
(заячья губа, волчья пасть, врожденый вывих бедра,
пороки сердца и сосудов и т.п.), часть из которых
выявляется не при рождении, а позже;
– 2% – люди, страдающие сложно
наследуемыми психическими заболеваниями
(шизофрения, маниакально-депрессивный синдром
и др.) и умственной отсталостью;
– 1% – люди, наследственность
которых отягощена генетическими дефектами,
вызывающими хронические и дегенеративные
заболевания (сахарный диабет, эпилепсия,
некоторые патологии щитовидной железы и обмена
веществ).
Приведенная оценка генетического
груза еще увеличится, если учесть внутриутробную
смертность, примерно в 25% случаев обусловленную
хромосомными аномалиями плода.
Мониторинг
К генетическим нарушениям,
обусловливающим генетический груз, относятся
мутации в половых, особенно в премейотических,
клетках, поскольку индуцированные в них
изменения могут сохраняться в течение всего
репродуктивного периода, а также рецессивные
мутации в специфических локусах в половых и
соматических клетках.
Для регистрации частоты мутаций
используются специальные линии мышей (5-, 7- и
однолокусная), у которых частоту мутаций
определяют по числу пятен на шерсти. Этот метод
называется «спот-тест» (от англ. spot – пятно) и
был рекомендован для экстраполяции данных о
характере действия химических и физических
мутагенов на человека, т.к. у человека и мыши
oдинaкoвая гeнeтичecкая чyвcтвитeльнocть (частота
спонтанных мутаций — 10–5). После того, как было
обнаружено, что у мыши возраст не влияет на
частоту спонтанных мутаций, а у человека она
может измениться в несколько раз, этот подход
подвергли пересмотру.
Существует более 200 тестовых систем
для определения мутагенного действия химических
и физических факторов.
В опытах in vitro для
регистрации генных мутаций используют тесты на
основе микроорганизмов, для анализа частоты
генных и хромосомных мутаций – различные
культуры клеток человека (лейкоцитов,
фибробластов).
В опытах in vivo для оценки частоты
летальных мутаций в Х-хромосоме используют
дрозофилу (метод Меллера), клетки паренхимы
корней Vicia faba, Crepis capillaries.
При этом учитывают цитогенетические
показатели частоты хромосомных аберраций (ХА),
сестринские хромосомные обмены (СХО), микроядра
(МЯ), плоидность хромосом (моноплоидия и
полиплоидия) в клетках крови, костного мозга
и др.
При прямых исследованиях мутационных
процессов у населения, живущего в экологически
загрязненных районах, определяют частоту
возникновения доминантных мутаций, изменяющих
нормальное течение внутриутробного развития и
вызывающих мертворождения, дефекты развития у
новорожденных. Изучают также вызванные
мутациями болезни детского и последующих
возрастов. Мониторинг должен включать учет
мутаций в половых и соматических клетках
человека.
Для определения механизмов действия
известных и подозреваемых токсичных, мутагенных
и канцерогенных веществ, а также для оценки
рисков, вызываемых ими, все шире используются
методы генной инженерии и биоинформатики.
Использование трансгенных животных вытесняет
спот-тест.
Для создания трансгенных животных в их
геном (ДНК) встраивают фрагмент экзогенной ДНК
(трансгенный вектор). ДНК вводят либо в
развивающуюся зиготу, либо в стволовые клетки
эмбриона. По мере развития эмбриона экзогенная
ДНК реплицируется и оказывается в ДНК всех его
клеток. Так получают «химерное» животное.
В 1995 г. было «сконструировано» более
200 линий мышей со специфическими генами.
Трансгеннные мыши с различными активными
онкогенами используются при изучении развития
опухолей. Например, «нокаут-мыши» широко
используются для оценки генных изменений в
процессе развития рака.
Появившиеся в последнее время новые
технологии – ДНК-микрочипы – позволяют выявлять
экспрессию генов, типы и частоты генных мутаций,
гены, вызывающие рак, и т.п.
При мониторинге успешно используют
также анализ мутаций генов, кодирующих синтез
изоферментов в крови человека. Выявление
аномального электрофоретического поведения
гемоглобина при серповидноклеточной анемии
человека послужило толчком к использованию
электрофоретических методов при изучении
наследственной изменчивости. Эти методы
позволяют определять варианты белков,
наследуемых строго по законам Менделя.
Результаты исследований белков у детей, резко
отклоняющихся от нормы по физическому развитию,
показали, что частота редких белковых вариантов
у них в семь раз выше средней частоты в популяции.
Перспективным является и метод
электрофореза ДНК в агарозном геле. Этот метод
апробирован на небольшой группе лиц (79 семей),
постоянно живущих в Могилевском районе,
загрязненном радионуклидами (137Cs и 131I) после
аварии в Чернобыле. С его помощью были обнаружены
новые мутации и двукратное увеличение частоты
наследственных мутаций у детей, родившихся в
период с февраля по сентябрь 1994 г., по
сравнению с детьми контрольной группы, родители
которых никогда не подвергались радиационному
воздействию (105 семей). Установлена надежная
корреляция между частотой мутаций и уровнем
загрязнения.
В последнее время совместно
используют биохимические методы и методы
молекулярной эпидемиологии. Так, по спектру
мутаций генов р53 и р21 можно
идентифицировать специфические канцерогены и
генетические изменения в ДНК, вызывающие рак у
человека. Возможно, в дальнейшем изменения в этих
генах будут применяться как биомаркеры
воздействий канцерогенов, а также для выявления
групп риска. Генотоксичные (вызывающих
увеличение частоты мутаций) канцерогены
выявляют и по фрагментации ДНК – одному из
основных проявлений апоптоза (генетически
запрограммированной гибели клеток).
Методики определения мутаций на
клеточном и молекулярном уровнях позволяют
выявлять группы риска как при
эпидемиологических обследованиях людей,
проживающих в экологически неблагоприятных
районах, так и среди представителей вредных
профессий. Использование новых генетических
методов в ряде случаев может привести к
пересмотру принятых гигиенических стандартов.
Количественная оценка генетического
риска химических мутагенов и ионизирующих
излучений
Для количественной оценки мутагенеза,
индуцированного действием низкоинтенсивных
физических и химических мутагенов,
представляющего реальную опасность для здоровья
и жизни не только ныне живущих, но и последующих
поколений, используют критерии количественной
оценки риска (КОР) и относительной генетической
эффективности (ОГЭ).
Для установления КОР определяют
зависимости «доза (концентрация) – эффект»,
действие физических и химических мутагенов в
«малых дозах», рассчитывают порог дозы
(концентрации), используют приемы экстраполяции
экспериментальных данных на человека.
Для оценки генетического риска
используют те же методы, что и для генетического
мониторинга.
В исследованиях in vitro и in vivo
показано, что частота мутаций линейно возрастает
с увеличением доз (концентраций) ионизирующей
радиации или химических мутагенов, но только в
диапазоне низких концентраций. При повышении доз
облучения мутагенный и (или) канцерогенный
эффект также увеличивается и достигает
максимума. Затем, при дальнейшем возрастании
уровня воздействия, частота мутаций или опухолей
снижается, что объясняется гибелью клеток.
Линейная зависимость частоты мутаций
от уровня воздействия (при низких дозах) показана
и для ряда химических мутагенов. Более детальные
исследования генетического риска выявили
нелинейную зависимость частоты мутаций при
действии ряда физических и химических мутагенов.
На культуре лимфоцитов крови установлено, что
при низкоинтенсивном облучении эта зависимость
имеет бимодальный характер: нарастание мутаций
при низких дозах до определенного максимума
(низкодозовый максимум), затем снижение и вновь
повышение частоты мутаций при дальнейшем
увеличении дозы. Величины и положения
низкодозового максимума зависят от природы,
мощности (концентрации) воздействия и времени
после воздействия облучения.
Ряд биохимических и гематологических
показателей у людей, облученных при авариях на
атомных станциях, также обнаруживают
бимодальную зависимость от дозы облучения. Среди
лиц, работающих на объектах атомной
промышленности США, Канады, Великобритании, а
также при обследованиях населения Японии и
России (район реки Теча), подвергавшихся
облучению, было зафиксировано резкое увеличение
частоты лейкозов при низких дозах облучения.
Ионизирущая радиация может выступать
в роли как промотора (активатора), так и
инициатора злокачественных новообразований.
Увеличение мощности и времени облучения (в
определенных пределах) снижает промотирущую и
увеличивает инициирующую функции воздействия.
При низкоинтенсивном облучении процессы
репарации генетических повреждений либо вовсе
не включаются, либо включаются не в полном
объеме.
Нелинейная зависимость частоты
мутаций от дозы установлена и при действии
токсических соединений и фармацевтических
препаратов в низких концентрациях. Такая
зависимость характерна для людей, проживающих в
экологически неблагоприятных районах.
Одной из актуальных задач при
исследованиях мутагенеза вследствие
загрязнения биосферы радиационными и
химическими мутагенами является анализ
особенностей процессов мутирования,
индуцированных воздействием мутагенов в малых
дозах. В последние годы получен много данных,
показывающих, что воздействия физических и
химических агентов при очень низких
концентрациях (10–11–10–15 М) вызывают
выраженные мутагенный и канцерогенный эффекты.
Критерии оценки генетического риска
Основным генетическим критерием
оценки мутагенности любого фактора является
определение частоты мутации (количество мутаций
на единицу (концентрации). Все другие оценки
мутагенности основаны на этом критерии.
Например, в радиобиологии принято
рассчитывать концентрацию, удваивающую уровень
естественного мутирования. В радиобиологии КОР
определяют в пределах либо линейной, либо
экспоненциальной зависимости частоты
мутирования на единицу дозы и рассчитывают
частоту мутаций на одну клетку.
Для оценки генетической опасности
химических соединений важно использовать, как и
в радиобиологии, еще один количественный
критерий – «относительную генетическую
эффективность» (ОГЭ) разных классов веществ.
Впервые ОГЭ рассчитал Эхлинг при сравнении доз
ионизирующего излучения и концентраций
химических мутагенов, вызывающих одинаковую
частоту мутаций. По мнению исследователя,
использование этого подхода для определения ОГЭ
не зависит от величины пороговой дозы
химического мутагена, и поэтому его генетическая
опасность может быть скорее завышена.
Другой способ определения ОГЭ основан
на использовании для сравнительной оценки
веществ одного и того же класса одинакового
способа воздействия и показателя мутагенного
эффекта, что позволяет рассчитать ОГЭ одного
соединения по отношению к другому.
Один из пoдxoдoв основан на определении
оценки риска эмбриотропного или тератогенного
эффектов (действия химических веществ,
повреждающих зародыш подопытных животных), когда
экспериментально устанавливают концентрации,
при которых эти эффекты не выявляются.
Предложено считать, что безопасный уровень для
человека определяется как концентрация,
вызывающая тератогенный или эмбриотропный
эффект не более чем у 1% животных.
Экстраполяция экспериментальных
данных на человека
Экстраполяцию экспериментальных
результатов, полученных в острых
токсикологических экспериментах, проводят для
определения безопасных уровней внешних
воздействий для человека.
Оценки риска канцерогенной опасности
для человека и, например, мышей различаются,
поэтому для экстраполяции требуются данные
оценок для большого количества разных животных.
В настоящее время получено множество
данных, свидетельствующих о неправомерности
экстраполяции биологических эффектов больших
доз ионизирующих излучений на эффекты низких
доз. При экспериментальном определении
последствий воздействия малых доз выявляются
эффекты, не наблюдаемые или маскируемые при
высоком уровне воздействия. К числу таких
эффектов относятся снижение чувствительности
биологических объектов к высокой дозе
повреждающего агента в результате
предварительного воздействия в малой дозе;
стимуляция пролиферации бактериальных и
животных клеток; интенсификация различных
биохимических и физиологических процессов при
облучении клеток и целостного организма, т.е.
адаптивных реакций (реакции приспособления). В
ряде случаев показано увеличение количества или
активности ферментов репарации повреждений ДНК
после воздействия радиации (или химических
мутагенов) в адаптивной дозе на клетки бактерий
или млекопитающих. В области малых доз может
наблюдаться более высокая эффективность в
расчете на единицу дозы излучения. Кроме того, в
окружающей среде не может быть изолированного
воздействия радиации – в действительности ее
действие комбинируется с действием химических
агентов. Это может приводить к усилению их
эффективности. В такой ситуации выделить или
определить последствия индивидуального
воздействия довольно трудно.
Для корректной экстраполяции
экспериментальных данных, полученных на
животных, на нормативы КОР онкологической
опасности для человека необходимо проведение
дозовых зависимостей мутагенов, а также
сочетание таких данных с установленными в
эпидемиологических исследованиях. Особенно
важно это в тех случаях, когда невозможно
определить характер зависимости
«концентрация–эффект». Например, для переноса
экспериментально установленных величин
генетического риска для радиации используют
модельную схему «человек/мышь», основанную на
сочетании оценок спонтанного мутационного
процесса у человека и индуцированного радиацией
мутагенеза у мышей.
Первые попытки лечения моногенных
заболеваний
Мутации появляются по стохастическим
(случайным, вероятностным) законам, и каждое
поколение платит за их появление ростом
генетического груза, самым очевидным
проявлением которого являются наследственные
болезни. До сих пор полное излечение больных с
наследственными недугами практически
невозможно, однако уже получены первые
обнадеживающие результаты применения методов
генной инженерии.
Первые попытки лечения моногенных
заболеваний с использованием методов генной
инженерии были предприняты в 1989 г. Генная
терапия наследственных и ненаследственных
(инфекционных) заболеваний состоит в введении
генов в клетки пациентов для исправления генных
дефектов или придания клеткам новых функций.
Главные трудности при этом
представляют эффективная доставка (трансфекция),
или трансдукция, чужеродного гена в
клетки-мишени и создание условий как для
длительного существования его в клетках, так и
для полноценной работы гена (его экспрессии).
Трансфекцию проводят с использованием
чистой ДНК, встроенной (легированной) в
соответствующую плазмиду, комплексированной с
солями, белками, органическими полимерами,
липосомами или частицами золота, или ДНК в
составе вирусных частиц, предварительно
лишенных способности к репликации.
В зависимости от способа введения
экзогеных ДНК в геном пациентов генную терапию
проводят либо в культуре клеток (in vitro), либо
непосредственно в организме человека (in vivo).
При клеточной генной терапии, или
терапии вне организма (ех vivo), выделяют и
культивируют специфические типы клеток
пациента, вводят в них чужеродные гены, отбирают
трансфецированные клетки и вводят их тому же
пациенту. В настоящее время в большинстве
случаев генной терапии используют этот подход.
Генная терапия in vivo основана на
непосредственном введении клонированных и
определенным образом упакованных
последовательностей ДНК в ткани больного.
Стандартная схема проведения
генокоррекции наследственного дефекта состоит
из следующих этапов:
1) создание полноценно работающей
(экспрессирующейся) генетической конструкции,
содержащей кодирующую белок (смысловую) и
регуляторную части гена;
2) выбор вектора, обеспечивающего качественную
доставку гена в клетки-мишени;
3) оценка эффективности коррекции дефекта в
условиях клеточных культур (in vitro) и на
модельных животных (in vivo).
Только после выполнения всех этапов
этой схемы можно переходить к программе
клинических испытаний.
В 1990 г. четырехлетней девочке с
наследственным иммунодефицитом, вызванным
мутацией в гене аденозиндезаминазы (ADA), ввели
ее собственные предварительно изолированные и
трансформированные лимфоциты. Трансформация
лимфоцитов вне организма (ех vivo)
осуществлялась введением в них гена ADA с
геном neo и ретровирусный вектором. Для
поддержания лечебного эффекта процедуру
проводили несколько раз с интервалом 3–5 месяцев.
За 3 года ребенку провели 23 внутривенные
трансфузии ADA-трансформированных
Т-лимфоцитов. Успех превзошел ожидания – девочка
смогла вести нормальный образ жизни, не опасаясь
случайных инфекций. Успешно прошло лечение и
второй пациентки с этим заболеванием. В
настоящее время проводятся клинические
испытания генной терапии этого заболевания в
Италии, Франции, Великобритании и Японии.
Для лечения наследственной семейной
гиперхолистеринемии (моногенная болезнь,
обусловленная мутацией гена-рецептора
липопротеина низкой плотности (ЛПН), успешно
использовали ретровирусные векторы, несущие
нормальные рецепторы ЛПН. У таких больных очень
высокий уровень холестерина в сыворотке крови,
что приводит к раннему атеросклерозу и инфаркту
миокарда. После введения пациенту
модифицированных клеток его печени через
портальную вену уровень холестерина у него
снизился на 10–15% и сохранялся в течение более 18
месяцев на низком уровне.
Одновременно с развитием исследований
в области генокоррекции наследственных дефектов
начата работа по разработке методов
терапевтического использования смысловых
(кодирующих последовательностей ДНК), для
лечения ненаследственных кодирующих
последовательностей ДНК т.е. для лечения
ненаследственных заболеваний (главным образом,
злокачественных и вирусных инфекций).
Большинство из них вполне пригодны и для борьбы с
такими инфекционными заболеваниями, как СПИД
(ВИЧ-инфекция).
Заключение
Приведенные в настоящей статье данные
показывают, что слабые воздействия физических и
химических факторов представляют реальную
опасность для ныне живущих и будущих поколений.
Следовательно, необходимы дaльнeйшие
исследования и корректировка имеющихся
стандартов для предупреждения возможного
увеличения генетического груза. Так, на
основании определения вероятных значений
максимально не действующей концентрации
винилхлорида в хроническом эксперименте (3,5 мг/м3)
была пересмотрена ранее установленная величина
его ПДК. Было установлено, что генетический
эффект Cr+6 (хрома) проявляется на уровне 1/10 его
ПДК. Поэтому крайне важно продолжать разработку
моделей для экстраполяции на человека
экспериментальных данных, особенно по
индуцированному химическому мутагенезу.
|