Карина Кочарова ;
Наталья Лысенко

Исследование микробной загрязненности воздуха в помещениях школы

Научно-экспериментальная работа

Окончание. См. № 18–19/2008

Экспериментальная часть

Материалы и методы

Приготовление питательных сред

Мясопептонный бульон (МПБ). К мясной воде прибавляют 1% пептона и 0,5% NaCl, кипятят на слабом огне 10–15 мин для растворения веществ, устанавливают нужный рН раствором NaOH с помощью индикаторных бумажек и снова кипятят 30–40 мин до выпадения осадка. Фильтруют, доливают до первоначального объема водой и стерилизуют 20 мин при 120 °С.

Мясопептонный агар (МПА). К готовому бульону добавляют 2% порошка агар-агара. Готовую среду, если нужно, осветляют, фильтруют и стерилизуют 20 мин при 120 °С.

Среда Лурия-Бертани (ЛБ). 1% бакто-триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% NaCl, 1,8% бакто-агара растворяют в воде, устанавливают рН 7,0 и стерилизуют 20 мин при 120 °С.

Желточно-солевой агар (ЖСА) – 10% NaCl, 10–20% желточной взвеси, 2% агара.

Перед разливом в чашки Петри агаровые среды расплавляют и остужают до 45–50 °С. Разливают среды в стерильные чашки в асептических условиях.

Отбор проб для определения общей обсемененности воздуха школьных помещений проводился седиментационным способом, основанным на механическом оседании микроорганизмов. Открытые чашки Петри со стерильной плотной питательной средой устанавливали горизонтально и экспонировали 10–20 мин в зависимости от предполагаемого загрязнения воздуха. Затем чашки закрывали, переворачивали вверх дном и выдерживали 24 ч при температуре 25–30 °С.

Определение общей обсемененности. На 2–3-й день культивирования просматривали чашки, фиксируя в журнале характер и интенсивность роста, морфологию колоний. Культуральные свойства определяли, изучая характер роста культуры с помощью лупы и под малым увеличением микроскопа. Величину и форму колоний, форму краев и прозрачность изучали в проходящем свете, рассматривая чашки со стороны дна. В отраженном свете (со стороны крышки) определяли характер поверхности колоний, окраску. Консистенцию определяли прикосновением бактериальной петли.

При идентификации бактерий (4-е сутки роста колоний) перечисляли их морфологические признаки: форму, наличие капсулы, жгутиков, окраску по Граму.
При окраске по Граму на мазок воздействуют двумя красителями: основным и дополнительным. Различные микроорганизмы неодинаково относятся к красителям трифенилметановой группы: генцианвиолету, метиловому или кристаллическому фиолетовому. Грамположительные (грам+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, не изменяют приобретенный фиолетовый цвет. Грамотрицательные (грам–) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате они обесцвечиваются и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

Приготовление мазков, их окраска по Граму. Исследуемый материал распределяли тонким слоем по поверхности обезжиренного предметного стекла. Мазок высушивали на воздухе, затем предметное стекло с препаратом брали пинцетом за ребра мазком вверх и проводили 2–3 раза над верхней частью пламени горелки. На фиксированный мазок наливали основной краситель и оставляли на 2–3 мин. Во избежание попадания осадка окрашивание вели через фильтровальную бумагу. Сливали краску, убирали фильтровальную бумагу. Мазок заливали на 1–2 мин раствором Люголя, затем раствор сливали, мазок прополаскивали в 96% этиловом спирте до обесцвечивания и промывали стекла в проточной воде. Затем окрашивали фуксином, снова промывали в проточной воде и высушивали фильтровальной бумагой. В результате грам+ бактерии окрашивались в темно-синий цвет, грам– – в красный.
Окрашенные по Граму мазки просматривали под микроскопом, фиксируя морфологию клеток.
Две колонии, подозрительные как стафилококковые, отвили на скошенный агар для дальнейшего исследования. Пробирки с посевом поместили в термостат при 37 °С на 18–20 ч. Затем пересадили колонии на дифференциальную среду – желточно-солевой агар, на котором патогенные стафилококки, например золотистый, способны выделять фермент лецитиназу.

Результаты исследований

Для окончательной идентификации и дифференциации микроорганизмов должны быть выделены чистые культуры, подобраны дифференциально-диагностические среды, позволяющие отличить один вид от другого по ферментативной активности, должны быть изучены культуральные свойства на жидких и плотных средах (на жидких средах отмечают прозрачность, наличие осадка или пленки), использованы биохимические методы (изучение ферментативных активностей и т.п.), изучено взаимодействие с антисыворотками, а в особо трудных случаях используют методы молекулярно-генетического анализа (изучение ДНК).

Из-за отсутствия возможности проведения таких исследований в условиях школы мы ограничились ориентировочным определением микроорганизмов. Мы установили форму и размеры колоний, их цвет и консистенцию. При микроскопических исследованиях шести визуально различных колоний определили форму микроорганизмов (кокки, бациллы, овоиды и т.п.), подвижность, отношение к окраске по Граму, наличие спор и капсул.

Количественные результаты по обнаружению микроорганизмов в разных школьных помещениях представлены в табл.1.

Таблица 1. Общая загрязненность воздуха

Морфологическое описание колоний микроорганизмов и очень приблизительное (учитывая вышесказанное) ориентировочное определение микроорганизмов до разных таксономических групп представлено в табл. 2, З.

Таблица 2. Морфологические свойства идентифицируемых бактерий

Таблица 3. Морфологические свойства идентифицируемых грибов

Выводы: в ходе эксперимента было установлено, что общая загрязненность воздуха в школе не превышает допустимых норм (санитарная норма – не более 50 колоний). Выделенные микроорганизмы лучше росли на среде ЛБ, чем на МПА, хотя последняя считается базовой для посевов микроорганизмов из воздуха. При этом среди бактерий отмечалось явное преобладание грам+ кокковой микрофлоры, наиболее распространенными представителями которой являются члены семейства Micrococcaceae (встречаются повсеместно). Это семейство включает роды Staphilococcus (сапрофиты, патогены, условные патогены) и Micrococcus (в основном сапрофиты), микрококки имеют пигмент от желтого до розового, и именно таких цветов колонии преобладают. В одной из колоний оказалась смешанная культура – палочки и кокки разных цветов, что, возможно, вызвано нарастанием колоний друг на друга. Кокки из этой колонии собраны в группы по 2 и 4, что позволяет предположить их принадлежность к сем. Sarcina, или Streptococcaceae. Еще одна культура с грам– палочками вызвала затруднения при идентификации, т.к. обычные почвенные палочки относятся к классам Bacilli и Clostridium и являются грам+. В филум Bacteroidetes входят грам– палочки, обитающие в почве, воде, на разных растениях, поэтому можно предположить, что наши бактерии из этого филума, но точное их определение затруднительно, хотя скорее всего это сапрофитные формы, занесенные с частицами почвы в раздевалку и коридор, где и были обнаружены.

Патогенной бактериальной микрофлоры не было обнаружено. Пересеянные на дифференциальную среду подозрительные колонии по заключению санитарно-эпидемиологической службы не являются колониями золотистого стафилококка.

При идентификации грибов основным критерием служило строение мицелия и спорангиев, или конидиеносцев. Надо отметить значительное присутствие в воздухе школы спор плесневых грибов, которые являются условно-патогенными и могут вызывать плесневые микозы (аспергиллез, мукороз, пенициллиоз) у людей со слабым иммунитетом. Это предполагает необходимость проветривания классных помещений и более тщательной влажной уборки с применением дезинфицирую-щих средств.

Заключение

Сейчас в развитых странах контролируется микологическое и бактериологическое состояние больниц, жилищ, офисов, общественных зданий, детских учреждений и т.д. Источником самых распространенных опасных плесеней (грибов рода Aspergillus) могут оказаться и сухие цветы или земляная смесь для комнатных растений. Кроме того, количество и состав пыли часто связаны с реконструкцией зданий, работой вентиляционных систем и кондиционеров. В воздухе в местах массовых скоплений людей всегда присутствует некоторое количество патогенных бактерий или их споры. Поэтому наша работа по мониторингу чистоты воздуха в школе очень важна для сохранения здоровья школьников, т.к. своевременное выявление возбудителей и меры по дезинфекции способны предупредить развитие локальных вспышек инфекции.

В перспективе возможны проведение аналогичных проверок микрофлоры воздуха для учета сезонных различий, замеры при отсутствии детей в школе (во время каникул), а также проведение посевов из смывов с различных поверхностей, которые дадут представление о загрязненности предметов, которых дети часто касаются руками (перила, дверные ручки, столы в столовых и т.п.).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Методические рекомендации. Методы бактериологического исследования условно-патогенных микроорганизмов в клинической микробиологии (утв. Минздравом РСФСР 19.12.1991).

2. Нетрусов А.И., Котова И.Б. Микробиология. – М.: Изд. центр «Академия», 2006.

3. Шлегель Г. Общая микробиология. – М.: Мир, 1986.

4. Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии. – М.: Изд. центр «Академия», 2005.

5. Грин Н., Стаут У., Тейлор Д. Биология в 3 т. – М.: Мир, 1996.

6. Курсанов Л.И., Наумов Н.А., Красильников Н.В. Определитель низших растений. Т. 3. Грибы. – М.: Советская наука, 1954.

Научные руководители:
В.В. КОРЧАГИНА,
Л.В. КОЗАДАЕВА,
Научный консультант:
Е.С. ЗУБКОВА,
Гимназия № 14, г. Одинцово, Моск. обл.