С.Ю. АФОНЬКИН

Гемофилия

Если же эта волокнина удалена, кровь не свертывается.

Аристотель

Мудрость «Талмуда»

22 марта 1791 г. в частной американской газете Салема «Gazette» была опубликована заметка о смерти 19-летнего юноши, причиной которой была небольшая резаная рана на ноге, кровоточившая несколько дней. Это была не первая подобная трагедия в семье несчастного молодого человека. В предыдущие годы пять его единокровных братьев умерли от таких же, казалось бы, незначительных травм. Так впервые в истории США был отмечен в печати случай семейной гемофилии – болезни несвертываемости крови.

Позже обобщение подобных случаев провел американский исследователь Джон Отто. Он составил множество генеалогических таблиц наследования гемофилии в Северной Америке и опубликовал свои данные в книге, вышедшей в свет в 1803 г. Вывод Отто был однозначен – болезнь передается в семьях по женской линии. Врач Грандидьер чуть позже назвал таких женщин кондукторами – «проводницами».

В выводах американских врачей не было ничего оригинального. На наследственную природу заболевания, передающегося по материнской линии, косвенным образом указывалось еще в «Талмуде» – своде религиозных трактатов иудаизма, где было записано буквально следующее: «Если у одной матери двое детей умерли от обрезания, то третий ее сын свободен от этого обрезания, все равно, будет ли он от одного и того же отца или от другого». Если же в результате операции два сына погибали у отца, который впоследствии вступил в брак с другой женщиной, то сын от последнего брака должен быть обрезан, поскольку на него не должна была распространяться странная кровоточивость погибших родственников. Религиозный обряд обрезания, столь важный для приверженцев ортодоксального иудаизма, связан с незначительным кровотечением. Следовательно, «Талмуд» рекомендовал не подвергать такому риску детей, у которых можно было подозревать наследственное нарушение свертываемости крови.

В 1100 г. арабский врач Алза-Гарави из Кордовы описал несколько деревенских семей, в которых многие мужчины страдали кровоточивостью, а в 1793–1798 гг. немецкий врач Ров писал об аналогичных семействах в Вестфалии. Однако это были лишь описания, не более. На семейную природу заболевания указывал Нассе в 1820 г. в своем капитальном сочинении «О наследственной склонности к смертельным кровотечениям», в котором он обобщил все известные ему указания на это заболевание.

Ген кровоточивости

Несмотря на появление подобных обзоров, до конца XIX в. причина этой странной болезни оставалась неясной. Врачи пытались объяснить ее то ненормальным развитием стенок кровеносных сосудов, которые якобы становились слишком тонкими, то гипертонией, то дефектами в строении эритроцитов, то влиянием гипофиза.

Первым указал на истинную причину заболевания в 1861 г. профессор Дерптского университета (ныне г. Тарту в Эстонии) наш соотечественник Александр Александрович Шмидт, создав ферментативную теорию семейной кровоточивости. Позже его предположения подтвердились: выяснилось, что в плазме крови больных не хватает некоторых белков, которые есть у здоровых людей.

Первое появление термина гемофилия историки медицины приписывают диссертации некоего Ф.Хопфа «О гемофилии, или наследственная склонность к смертельным кровотечениям», защищенной в 1928 г. в Вюрцбюрге. Современникам Хопфа слово не понравилось. «Слово «гемофилия» столь дико и бессмысленно, что никто им не гордится», – писали они. Тем не менее, несмотря на первое негативное восприятие, термин устоялся и дошел в неизменном виде до наших дней.

Уже знакомые с генетической терминологией и законами наследования признаков немецкие исследователи Бауэр и Шлосман в 1922–1924 гг. указывали, что наследование гемофилии сцеплено с полом и имеет рецессивный характер. Это означало, что дефектный ген находится в одной из двух женских Х-хромосом. При наличии у женщин нормального гена во второй Х-хромосоме заболевание не проявляется. У мужчин же всего одна Х-хромосома, полученная от матери, поэтому, если такая хромосома содержит дефектный ген, его действие проявится обязательно.

Это несложное рассуждение хорошо объясняло наследование гемофилии в семьях, где от заболевания страдали только мужчины. Так, например, хорошо известно, что четвертый сын (восьмой ребенок) английской королевы Виктории I страдал гемофилией и умер от нее. Следовательно, его мать была носительницей дефектного гена. Этот ген она передала двоим из пяти дочерей. Они, в свою очередь, передали его далее в ряду поколений. В частности, дочь Виктории, Беатрис, вышла замуж за Генриха, принца Баттенбергского. Двое мальчиков от этого брака умерли во младенчестве от кровотечений. Вторая дочь Виктории, носительница гена гемофилии Алиса, вышла замуж за Людовика, принца Гессенского. От этого брака на свет появились два сына, один из которых страдал гемофилией, и пять дочерей, две из которых – Ирген и Александра – также унаследовали ген «кровоточивости».

Тромбоциты

По счастью, гемофилия встречается довольно редко – почти в 8 раз реже, чем печально знаменитый синдром Дауна. По статистике один гемофилик приходится на 8 тыс. рожденных мальчиков. Казалось бы, это мало, однако только в США гемофилией страдают 20 тыс. американцев – целая армия!

Этим людям угрожают не только внешние, но и внутренние кровотечения. В последнем случае вытекающая из поврежденных сосудов кровь начинает распространяться вдоль мышц, и окружающие их ткани нередко разбухают. В результате возникает тканевой фиброз, последствием которого может быть судорожное сведение пальцев рук – так называемый эффект «когтистой лапы». Кровь, попавшая в суставные сумки, надолго лишает сустав подвижности. Хрящ суставов начинает разрушаться, становится губчатым, рыхлым. Кости подвергаются кальцификации и становятся ломкими.

В общем, быть гемофиликом – удовольствие маленькое. К счастью, в наши дни многие из этих неприятных последствий снимаются специальными препаратами.

Главными клетками, ответственными за свертывание крови, являются тромбоциты. Впервые они были описаны в середине XIX в. профессором гематологической клиники при Парижской академии наук доктором Александром Донне. В 1880 г. наш соотечественник В.П. Образцов доказал, что тромбоциты образуются из огромных клеток мегакариоцитов, «отшнуровываясь» от их поверхности. Если не слишком аккуратно вылить на сковородку блинное тесто, то образующийся блин с неровными краями будет очень похож на мегакариоцит с отсоединяющимися от него тромбоцитами.

Внешний вид тромбоцитов, клеток, которые участвуют в процессе свертывания крови и восстановлении кровеносных сосудов

В процессе свертывания крови, волокна фибрина окутывают эритроциты

Тромбоциты – самые маленькие клетки крови. Они имеют округлую форму и редко достигают в диаметре 5 мкм, т.е. одной двухсотой части мм, однако их значение трудно переоценить. Есть данные о том, что тромбоциты являются «кормильцами» клеток, образующих внутреннюю поверхность кровеносных сосудов. Прикрепляясь к ним, они отдают питательные вещества, возможно, погибая при этом. Во всяком случае общий запас тромбоцитов в крови даже при отсутствии каких бы то ни было кровотечений постоянно пополняется. ежедневно образуется до 15% тромбоцитов. Однако для нашего рассказа это сейчас не главное. Как следует из самого названия этих клеток, именно тромбоциты ответственны за образование тромбов при повреждении кровеносных сосудов. Происходит это следующим образом.

Как образуются тромбы

При разрыве кровеносного сосуда нарушается его эндотелиальная выстилка, т.е. повреждаются клетки, которыми он выстлан изнутри. Под выстилкой лежат длинные волокна основного белка соединительной ткани – коллагена, к которому тромбоциты способны прилипать. Прочное прикрепление тромбоцитов к поверхности раны ведет сразу к нескольким важным последствиям. Вопервых, внутри прикрепившегося тромбоцита сжимается своеобразное кольцо из микротрубочек, в результате чего меняется форма клетки и на ее поверхности возникают многочисленные выросты, что способствует закреплению его в ране. Во-вторых, на его поверхности появляются белки, которые нужны для прикрепления к нему новых тромбоцитов. Образно говоря, проникшие в рану тромбоциты подают сигнал: «Сюда, к нам! Здесь нужна экстренная помощь». Из кинувшихся на подмогу тромбоцитов начинает выделяться биологически активное вещество – гормон серотонин. Под его воздействием за счет сокращения гладкой мускулатуры начинается локальная вазоконстрикция, а попросту – местное сокращение просветов сосудов. Значение этого процесса для остановки кровотечения ясно и без комментариев. Наконец, прилипшие к ране тромбоциты выделяют вещество, стимулирующее деление клеток гладких мышц. Тоже понятно – края разрыва надо стянуть с помощью мускулатуры.

Если поврежденным оказался капилляр, нередко кучи навалившихся на место повреждения тромбоцитов оказывается вполне достаточно, чтобы закрыть место разрыва своими телами. Если же поврежден более крупный сосуд, включается механизм образования фибриновой пробки. Происходит это следующим образом.

Прикрепленные к ране тромбоциты выделяют специальное вещество – так называемый фактор контакта, который запускает целый каскад взаимодействий различных белков, участвующих в образовании тромба. Их насчитывается более 10, и многие из них названы фамилиями пациентов, у которых гемофилия была связана с отсутствием в крови именно этого компонента. Так, например, существуют факторы Коллера, Розенталя и Хагемана. По мнению многих экспериментаторов в начале XX в. номенклатура факторов свертывания крови была сравнима с Вавилонской башней. Каждый фактор у разных авторов назывался по-своему и мог иметь до 20 синонимов! Порядок удалось навести лишь в начале 1950-х гг., когда была создана единая терминология, принятая теперь во всем мире. Она включает 12 факторов, пронумерованных латинскими цифрами. Большинство из этих факторов – сложно устроенные белки.

Впечатление от сложной схемы взаимодействий факторов свертывания крови точно выразил в одном из своих сочинений французский исследователь гемофилии Ж.Фермилен: «Сложность этой схемы может охладить интерес к изучению данной проблемы». Поэтому, не вдаваясь в тонкости, отметим лишь ее ключевые моменты.

Белок, выделяющийся из тромбоцитов при контакте с раной, опосредованно стимулирует фермент протромбиназу. Протромбиназа действует на белок протромбин, превращая его в тромбин, а тромбин, в свою очередь, воздействует на главный белок, необходимый для образования тромба, – фибриноген. Его в нашем теле совсем мало – всего около 10 г, однако этого количества оказывается достаточно, чтобы система свертывания крови работала эффективно.

Фибриноген – очень большой белок. Под действием тромбина от фибриногена отщепляется пара пептидных фрагментов и открываются участки, необходимые для запуска полимеризации. В результате возникает так называемый фибрин-мономер, способный активно соединяться с такими же мономерами в длинные неразветвленные цепи. На существование нитей фибрина указывал еще Аристотель, назвав основной компонент сгустка крови «волокниной». Мономеры фибрина напоминают строительные блоки конструктора «Лего», из которых легко можно построить длинную балку.

Образующиеся полимерные нити фибрина стабилизируются специальным белком фибриназой. Таким образом, в ране образуется настоящая заплатка из густо переплетенных нитей фибрина. Образующиеся нити фибрина инактивируют тромбин. Если бы этого не происходило, тромбин мог бы свернуть всю кровь в организме.

Ясно, что фибриновая пробка не может существовать бесконечно долго. Довольно скоро клетки эндотелия и гладкой мускулатуры закрывают собой образовавшуюся брешь в стенке сосуда, и тогда сгусток начинает мешать восстановившемуся кровотоку. Следовательно, его надо удалить, и это делает еще один участник тромбогенеза – фермент фибринолизин. Под его воздействием фибриновый тромб начинает распадаться и вскоре полностью исчезает. Для того чтобы фибринолизин не слишком уж рьяно растворял сгустки – они не должны исчезнуть раньше времени, – на него тоже есть управа в виде белка антифибринолизина. Кстати сказать, в крови умерших людей активность фибринолизина остается достаточно высокой на протяжении длительного времени. В результате этого трупная кровь не сворачивается, как это можно было бы ожидать, исходя из житейских рассуждений. Подобный эффект позволил в 1936 г. отечественным хирургам С.С. Юдину и В.Н. Шамову разработать и внедрить в практику переливание пациентам крови трупов. В настоящее время такая методика не практикуется, однако ее применение возможно в экстремальных ситуациях дефицита донорской крови.

Десятки тумблеров

Помимо 12 пронумерованных факторов в процессе свертывания крови участвуют в общей сложности около 60 различных соединений. Как объяснить такую, на первый взгляд избыточную сложность каскада белковых взаимодействий? Дело в том, что процесс образования тромбов очень важный и в то же время опасный. Только представьте себе, что кровь начнет самопроизвольно образовывать тромбы в капиллярах или, наоборот, свертываемость станет слишком низкой. В обоих случаях катастрофические последствия неизбежны.

Не вызывает сомнения, что сама степень свертываемости должна меняться в зависимости от внешних и внутренних условий, т.к. сложные процессы необходимо тонко регулировать. Вспомните в зале управления электростанцией или в кабине самолета на пульте не две большие кнопки – «Вкл.» и «Выкл.», а десятки тумблеров и рычагов, с помощью которых можно оказывать влияние на самые разные фазы процесса. Обилие прямых и обратных связей, осуществляющихся в процессе образования фибрина и его последующей дезинтеграции, как раз и позволяет очень тонко регулировать эти превращения.

Известно, например, что на процесс свертывания крови оказывают влияние вегетативная нервная система, гормоны и головной мозг. В частности, под воздействием незначительного стресса свертываемость может уменьшаться. Логически такой эффект вполне обоснован. Обычно состояние стресса готовит организм к предстоящим физическим нагрузкам – учащается сердцебиение, увеличивается потоотделение, необходимое для охлаждения при беге или борьбе. Снижение свертываемости и, как следствие, увеличение «жидкостности» крови в этой ситуации будет способствовать ее лучшему и быстрому прохождению через самые тонкие капилляры.

С другой стороны, эмоциональное возбуждение и страх перед предстоящей операцией способны увеличить свертываемость. Разумеется, эволюция не готовила человека заранее к полостным операциям, однако факт остается фактом – эмоции влияют на фибриногенез. Возможно, этим объясняется тот факт, что Григорий Распутин голосом и взглядом мог останавливать кровотечения у гемофилика царевича Алексея.

Хороший пример «мудрости» фибриногенеза дают опыты с избытком тромбина. Теоретически содержащегося всего в 10 мл крови протромбина должно оказаться достаточно, чтобы образовавшийся из него тромбин превратил весь фибриноген тела человека в фибрин, т.е. чтобы свернулась вся кровь. На деле же, в экспериментах на животных, этого не происходит. Более того, инъекции больших доз тромбина не ускоряют, а во много раз замедляют свертываемость крови у подопытных крыс. Хотя молекулярный механизм этого явления еще до конца не ясен, логика проста.

Действительно, в нормальных условиях концентрация тромбина в крови не должна выходить за разумные рамки, и если, образно говоря, стрелку зашкаливает, т.е. концентрация тромбина подскакивает выше предельно допустимой, включаются механизмы, тормозящие свертываемость. Другими словами организм «понимает», что при резком скачке концентрации тромбина надо не кровь сворачивать, а нормализовать механизм поступления тромбина в кровь и заодно обезопасить себя от массового появления тромбов и сгустков, резко уменьшив свертываемость крови.

Ген фактора VIII

Редко кто из гемофиликов доживал до 20 лет, пока не появилась эффективная терапия. В настоящее время несколько фармакологических компаний выпускают целый ряд препаратов, способных восстанавливать свертываемость крови гемофиликов. Большая часть этих препаратов представляет собой лиофилизированные (высушенные в определенных условиях) концентраты крови здоровых людей, а стоимость лечения ими составляет 6–10 тыс. долларов в год. К тому же всегда существует опасность вместе с таким концентратом получить какой-нибудь вирус (например, ВИЧ). Поэтому неудивительно, что делаются попытки наладить выпуск лекарств против гемофилии методами генной инженерии.

У 80–85% больных гемофилией в крови отсутствует так называемый фактор VIII (антигемофильный глобулин). Такая гемофилия считается классической и обозначается буквой А. В остальных случаях (гемофилия В) в крови больных не хватает фактора IX.

Фактора VIII в крови совсем немного. Достаточно сказать, что на одну молекулу антигемофильного глобулина в кровяном русле приходится 1 млн молекул альбумина – одного из основных белков плазмы. Однако фактор VIII играет одну из ведущих ролей в каскаде реакций, стимулирующих превращение фибриногена в фибрин, и поэтому его отсутствие неизбежно приводит к гемофилии.

В 1980-е гг. американская фирма Genetech начала производить антигемофильный глобулин с помощью генно-инженерных методик. За этим выдающимся достижением стояла поистине ювелирная работа молекулярных биологов Ричарда Лона, Гордона Вихара и их сотрудников. Первой целью ученых было найти ген антигемофильного глобулина среди сотен тысяч генов человеческого организма. Задача сама по себе нелегкая, однако если учесть, что значимые, работающие гены составляют лишь часть ДНК человека, то предстоящая работа представлялась поистине титанической.

Однако, по счастью, в молекулярной биологии давно были разработаны подходы для решения подобных задач. Для работы были взяты информационные РНК – то есть уже снятые клетками копии с ДНК, которые нужны для синтеза белков. Где-то среди этих молекул был и кусочек цепи нуклеотидов, кодирующий фактор VIII. Затем с помощью специального фермента обратной транскриптазы одноцепочечные РНК были превращены в двухцепочечные нити ДНК – по сути дела в одиночные гены. Все полученные кусочки были встроены в геном вируса «лямбда». Обычно это встраивание проводят таким образом, чтобы каждый вирус получил по одному кусочку ДНК. В результате все гены были «рассованы» по вирусам. Теперь среди них оставалось только найти единственный нужный.

Вирусы «лямбда» нападают на бактерии и размножаются с их помощью. Лон и Вихар рассеяли вирусы по поверхности слоя бактерий в чашках с питательной средой. Через некоторое время на таком «бактериальном газоне» возникли светлые пятна – следы гибели бактерий, вызванной размножением вирусов. Каждое пятно содержало миллиарды потомков одного вируса, попавшего на данное место «газона». Где-то среди таких пятен было и пятно с вирусами, содержащими нужный ген фактора VIII. Как его найти?

Для этого надо было знать хотя бы что-то об этом гене. Соответствующую информацию можно было получить, изучив белок фактора VIII. Для этого его надо было получить в чистом виде. Всего несколько миллиграммов фактора VIII было выделено из 25 тыс. л бычьей крови. Затем группа ученых из Королевской больницы в Лондоне взялась за изучение строения антигемофильного глобулина. В результате удалось разобраться в общей структуре молекулы и записать последовательность двенадцати аминокислот маленького ее кусочка. Для дальнейшей работы этого пока было достаточно.

Каждая аминокислота зашифрована в ДНК тройкой нуклеотидов. Следовательно, теперь можно было определить, как именно расположены нуклеотиды маленького куска гена фактора VIII. Проблема состояла в том, что различных троек нуклеотидов больше, чем нужно для кодирования 20 аминокислот, поэтому некоторым аминокислотам соответствует не одна, а две или более троек. В результате, несмотря на то, что был изучен всего лишь небольшой фрагмент фактора VIII, теоретически можно было получить более 147 тыс. вариантов расположения кодирующих его нуклеотидов. Однако знания и опыт молекулярных биологов позволили значительно сузить диапазон поисков, и был синтезирован наиболее вероятный вариант.

С помощью небольшого полученного кусочка гена фактора VIII, который сыграл роль своеобразной «наживки», среди тысяч пятен с размножившимися вирусами было выбрано одно, содержащее нужный ген.

Длина «пойманного» таким образом гена антигемофильного глобулина оказалась очень большой – 186 тыс. пар оснований. Устроен он оказался очень любопытно. в нем 26 экзонов, т.е. значимых последовательностей, и они занимают менее одной двадцатой части длины гена. Остальную часть гена составляют ничего не значащие вставки – интроны. Если представить ДНК в виде текста какого-нибудь известного стихотворения, то читать его будет очень неудобно. Представьте себе, что вы видите строчку: «Гляжу – поднимается медленно в гору...», и только через полстраницы случайного набора букв находишь продолжение: «Лошадка, везущая хворосту воз».

Подобное устройство генов – не сюрприз. В процессе трансляции, т.е. снятия РНК-копии с гена, необходимой для синтеза белка, все интроны игнорируются, а экзоны оказываются состыкованными в единую значимую цепь. Точность подобной молекулярной «корректурной правки» потрясает воображение. Ведь ошибка даже на одну пару оснований привела бы к тому, что вместо нужного белка будет синтезирован совершенно другой. А таких пар оснований в гене антигемофильного глобулина более 1,5 тыс.!

Выделенный ген антигемофильного глобулина человека позволил не только синтезировать фактор VIII, но и подробно изучить этот белок. Антигемофильный глобулин представляет собой огромную молекулу. Этот белок состоит из 2332 аминокислот и имеет молекулярную массу 330 кДа (1 кДа = 1000 Да (Дальтон) = 1,66ґ10–21 г). Для сравнения – белок интерферон, помогающий нашим клеткам бороться с вирусными инфекциями, имеет массу всего 19 кДа, т.е. в 17 раз меньше. Компьютерный анализ аминокислотной последовательности фактора VIII показал, что в ней есть три участка, в точности соответствующие трем участкам в аминокислотной последовательности церулоплазмина – белка, который переносит ионы меди в нашем организме. Этот любопытный факт говорит о том, что в процессе эволюции сложные белки возникали за счет комбинации более простых «строительных деталей».

Детальный анализ показал, что ген антигемофильного глобулина у разных больных гемофилией А может иметь различные повреждения. Сейчас известно не менее семи подобных повреждений, из которых четыре представляют собой точковые мутации, т.е. замены единичных нуклеотидов, приводящие к замене всего одной аминокислоты в белке. Остальные нарушения представляют собой делеции – потери небольших участков гена.

Как уже упоминалось, не все случаи гемофилии можно объяснить отсутствием в крови больных антигемофильного глобулина. У небольшой части больных не хватает других белков, влияющих на свертываемость крови. Не вызывает сомнения, что и эти более редкие случаи будут со временем подробно изучены, и в результате будут созданы соответствующие лекарственные препараты против гемофилии.