И.Ю. КУДИНОВА,
В.А. КРАТАСЮК,
Красноярский государственный университет,
Институт биофизики СО РАН, г. Красноярск

Да здравствует мыло... мягкобактерицидное!

Исследование действия мыла на бактерии биолюминесцентным методом

Современная биология характеризуется трудоемкими, сложными и дорогостоящими методами, которые невозможно использовать в школьном образовании. Однако существуют исключения.
К ним относятся биолюминесцентные методы. Возможно, в будущем они будут широко использоваться в школьных лабораториях.В экспериментальной школе №106 «Универс» Красноярска осенью 1999 г. была создана учебно-научная экологическая лаборатория и проводился биолюминесцентный практикум с использованием светящихся бактерий.
На одном из занятий в лаборатории мы раздали учащимся пузырьки со светящимися бактериями и предложили самостоятельно провести с ними какие-нибудь эксперименты. На следующем занятии оказалось, что бактерии подверглись самым разным воздействиям: облучению, охлаждению, нагреванию, действию самых разных веществ. Как оказалось, большинство учащихся исследовали действие различных моющих средств на свечение бактерий. Один из них вскоре отважился на более серьезную работу – исследование механизма действия моющих средств на бактерии.
Цель данной публикации – дать пример творческого исследования школьника с использованием биолюминесцентных систем. Это позволит читателю получить конкретное представление о биолюминесценции и использовании биолюминесцентных методик.
Мы используем огромное количество моющих средств. Грязная вода после этого сливается в миллионы канализационных труб и попадает в близлежащие реки и озера. Иногда она проходит предварительную очистку, иногда нет. Даже если сточные воды прошли очистку, некоторые их компоненты не разрушаются.
Попав в водоем, они могут нарушить в нем экологическое равновесие. В связи с этим необходимы быстрые методы определения биологического действия сточных вод.
В последнее время широкое распространение получили биотесты на основе бактериальной биолюминесценции. Биолюминесцентное тестирование относится к интегральным способам определения токсичности, которые позволяют выявлять не отдельные вредные вещества, а их общебиологическое действие и одновременно оценивать возможные эффекты их взаимоусиления или ослабления.
Впервые биотест с использованием биолюминесцентных бактерий был применен в 1963 г. В 1980 г. этот метод был стандартизирован в Германии как способ обнаружения загрязнений. Позже этот метод модифицировался различными исследователями.
В 1990 г. для биотестирования было предложено использовать водорастворимые ферментативные биолюминесцентные системы (in vitro).
Биолюминесцентные системы (in vitro и in vivo) одновременно использовались для мониторинга сточных вод и природных водоемов Алтайского и Красноярского краев, а также искусственных водных экосистем.
Опыт использования биолюминесцентных систем показал, что в ряде случаев они обладают различной чувствительностью к токсикантам. Поэтому для их практического использования необходимо сравнение их чувствительности к различным классам химических соединений.
Один из способов изучения биолюминесцентных систем, используемых в качестве биотестов, – исследование изменений их кинетических параметров под действием соединений различных химических классов с известными свойствами.
Цель данной работы: исследование действия растворов моющих средств на две биолюминесцентные системы различной сложности – светящиеся бактерии Photobacterium phosphoreum и водорастворимую биферментную систему
NADH:FMN-оксидоредуктаза-люцифераза, а также выявление связи между результатами биолюминесцентного анализа и влиянием моющих средств на поверхностное натяжение.

Глава I. Обзор литературы

1.1. Бактериальная биолюминесценция

Биолюминесцения – это свечение живых организмов. Светящиеся бактерии – единственные светящиеся организмы, используемые в измерительных системах биотестирования токсичности. Бактериальная биолюминесценция представляет собой процесс окисления субстрата (люциферина) в присутствии специфического фермента (люциферазы).

FMN+NADH --> FMNH₂ +NAD⁺

FMNH₂+О₂+RCOO --> RCOOH +FMN + H₂О + hv

Биолюминесцентный сигнал представляет собой последовательность импульсных сигналов, следующих с частотой около 0,02 Гц, а каждый пакет состоит из 5–10 хорошо сформированных импульсов, следующих с частотой около 1 Гц. В течение одного импульса высвечивается 10 фотонов. В отличие от интенсивности свечения, спектр бактериальной биолюминесценции не зависит от внешних условий.

В работе использована культура бактерий Photobacterium phosphoreum, которые представляют собой короткие палочки, или коккобациллы, с размерами (1–2,5)x(0,4–1) мкм. Они подвижны благодаря наличию одного жгутика или целого пучка полярных жгутиков и относятся к хемоорганотрофам. Аэробы. оптимальная температура 20–30 °С. Растут при концентрациях NaCl от 0,5 до 5% (без NaCl не растут) и рН 6,0–9,0. Оптимальной является концентрация NaCl 3%. Спектр свечения лежит в области 420–600 нм с максимумом 472 нм.

1.2. Как моет мыло?

Основным компонентом моющих средств являются поверхностно-активные вещества (ПАВ). Действие ПАВ основано на изменении поверхностного натяжения на границе раздела фаз. Поверхностное натяжение характеризуется силой, которая действует вдоль поверхности жидкости перпендикулярно к силе, ограничивающей эту поверхность, и стремится сократить ее до минимума. Причиной возникновения поверхностного натяжения является нескомпенсированность межмолекулярных сил на границе раздела фаз.

Сырьем для получения ПАВ служат жирные кислоты (растительные и животные), нефтяные парафины и т.д. Кроме ПАВ моющие средства содержат еще множество компонентов (загустители, отдушки, бактерицидные вещества и т.д.). В качестве бактерицидных веществ в моющие средства могут входить растительные экстракты, этанол, галогенированные производные фенолов, дифенилового эфира и т.д.

Глава II. Материалы и методы

2.1. Измерение биолюминесценции светящихся бактерий

В работе использованы наборы кювет, микропипетки емкостью от 5 мкл до 1 мл, флаконы емкостью 5–10 мл, весы аналитические ВЛР-200 (II класс ГОСТ 19491–74) и другое лабораторное оборудование. Для регистрации биолюминесценции использованы биолюминометр БЛМ 8804, изготовленный в Институте биофизики СО РАН, и самописец 2210 («LKB», Швеция). При анализе действия исследуемой группы соединений на биолюминесценцию светящихся бактерий Photobacterium phosphoreum использовали лимфилизированный препарат бактерий «Микробиосенсор B-1760F», разработанный и изготовленный в Институте биофизики СОРАН. В работе использовали следующие свежеприготовленные растворы: к флакону препарата бактерий добавляли 2 мл 1,5%-ного раствора NaCl, растворы моющих средств с концентрацией 10 мг/мл готовили на 3%-ном растворе NCl. Концентрация С(х) моющих средств в исследуемых растворах составляла 10–2 мг/мл.

Эффективность воздействия характеризовали бактериальным индексом (БИ):

БИ = I0/Ik, где I0 – интенсивность свечения опытной кюветы, Ik – интенсивность свечения контрольной кюветы.

2.2 Биферментная система

В работе использовали свежеприготовленные растворы NADH (4 мМ) и FMN (4 мМ); для получения 0,002%-ного раствора тетрадеканаля 50 мкл 0,2%-ного раствора тетрадеканаля тщательно размешивали в 5 мл фосфатного буфера (рН 6,8–7,0). Во флакон реагента NADH-КРАБ (комплект реактивов аналитической биолюминесценции), который содержал 0,11 мг люциферазы и 0,069 ед. активности NАDH:FМN-оксидоредуктазы, вносили 500 мкл 0,02 М фосфатного буфера. Раствор хранили на льду.

Измерение биолюминесценции проводили следующим образом. В кювету биолюминометра вносили последовательно:

• 5 мкл раствора КРАБ;

• 50 мкл 0,002%-ного раствора тетрадеканаля;

• 200 мкл 0,02 М фосфатного буфера или раствор исследуемого вещества;

• 200 мкл 0,4 мМ раствора NADH;

• 50 мкл 0,4 мМ раствора FMN.

Эффективность воздействия характеризовали люциферазным индексом (ЛИ):

ЛИ = I0/Ik, где I0 – интенсивность свечения опытной кюветы, Ik – интенсивность свечения контрольной кюветы.

2.3. Измерение поверхностного натяжения

В работе использованы мерные колбы на 20 мл, рамка из тонкой проволоки, весы чашечные, песок, штангенциркуль, емкости с водой. Поверхностное натяжение было рассчитано по формуле:

d = mg/2l, где d – коэффициент поверхностного натяжения, g – ускорение свободного падения, m – средняя масса песка при отрыве рамки от поверхности воды, l – длина рамки.

Глава III. Результаты и обсуждение

3.1. Действие моющих средств на биолюминесценцию

Результаты измерений изменения интенсивности люминесценции биферментной системы и бактерий Photobacterium phosphoreum под действием моющих средств представлены на рис. 1.

Рис. 1. Влияние моющих средств на интенсивность биолюминесценции бактерий (БИ) и (ЛИ). Мыло: 1 – «детское»; 2 – турецкого производства; 3 – «Saveguard»; 4 – «витаминизированное» (ф-ка «Свобода»); 5 – «мягкобактерицидное» (ф-ка «Свобода»); 9 – «хозяйственное». Порошки: 6 – «Лоск», 7 – «Tide»; 8 – «Эрго». Моющее средство: 10 – «Fairy»

Анализ полученных результатов проводили в рядах мыл и порошков. Как видно из рис. 1, наименьшее действие на свечение бактерий оказывает «детское» мыло (1). Среди исследованных моющих средств оно характеризуется наименьшим значением БИ, следовательно, характеризуется наименьшим бактерицидным действием. В то же время «мягко бактерицидное» мыло (5) ф-ки «Свобода» при той же концентрации (10–2 мг/мл) полностью ингибирует свечение бактерий, что свидетельствует о наличии в его составе активных бактерицидных веществ. Наличием бактерицидных веществ изначально характеризуется и мыло «Saveguard» (3), однако, действие его на биолюминесценцию бактерий значительно меньше, чем мыла (5), что, вероятно, связано с иным химическим составом и меньшей концентрацией в нем бактерицидных веществ.

Среди исследованных средств для стирки белья максимальное воздействие на свечение бактерий оказывает порошок «Эрго» (8) и хозяйственное мыло (9), минимальное – «Лоск» (6).

Сравнивая эффективность воздействия моющих средств на биолюминесценцию биферментной системы, можно отметить, что в большинстве случаев изменения ЛИ коррелируют с изменениями БИ. Значения ЛИ обычно меньше, чем соответствующие значения БИ, поэтому можно предположить, что доступ к центру светоизлучения клетки компонентов моющих средств затруднен в связи с защитными функциями мембраны. Однако для «мягкобактерицидного» мыла (5) ЛИ больше, чем БИ. Вероятно, это связано с тем, что его компоненты действуют на реакцию биолюминесценции опосредованно, оказывая влияние на метаболизм клетки в целом. По-видимому, нарушается функционирование мембраны клетки (ингибируется транспорт веществ или вообще происходит ее разрушение и гибель клетки), что и приводит к полному ингибированию свечения.

3.2. Поверхностное натяжение моющих средств

Результаты измерений поверхностного натяжения (d) растворов исследованных моющих средств представлены на рис. 2.

Рис. 2. Поверхностное натяжение растворов исследованных моющих средств. Мыло: 1 – «детское»; 2 – турецкого производства; 3 – «Saveguard»; 4 – «витаминизированное» (ф-ка «Свобода»); 5 – «мягкобактерицидное» (ф-ка «Свобода»); 9 – «хозяйственное». Порошки: 6 – «Лоск»; 7 – «Tide»; 8 – «Эрго»

Минимальным значением d характеризуется мыло турецкого производства (2), следовательно, можно предположить, что в сравнении с другими моющими средствами оно содержит большее количество ПАВ. В остальных случаях не наблюдалось больших изменений значений d.

В результате сравнения значений d (рис. 2), ЛИ и БИ (рис. 1) определенной связи между этими величинами не обнаружено, следовательно, эффективность воздействия на биолюминесценцию определяется не содержанием ПАВ, а действием различных специфических добавок, веществ, имеющих бактерицидную или бактериостатическую активность.

Выводы

Исследовано влияние группы моющих средств на две биолюминесцентные системы: светящиеся бактерии Photobacterium phosphoreum и водорастворимую биферментную систему NADH:FMN-оксидоредуктаза-люцифераза.

В результате работы установлена различная ингибирующая способность моющих средств. Показано, что в большинстве случаев биферментная система более чувствительна к действию мыл и порошков, чем бактерии, что связано с защитными функциями «мембран».

Измерены поверхностные натяжения водных растворов моющих средств. Сравнение их с БИ и ЛИ позволило сделать предположение, что ингибирование биолюминесценции происходит не за счет поверхностной активности ПАВ, а за счет воздействия специфических компонентов, входящих в состав моющих средств.

В работе показано, что использование двух методов – биолюминесцентного анализа и измерения поверхностного натяжения – позволяет выявить моющие средства с хорошими мыльными качествами, оказывающие минимальное воздействие на биологические системы.

Работа выполнена при поддержке Красноярского краевого фонда науки, грант № 1М0044, 1999–2000 гг.