Ю.А. ЛАБАС
Белки, которые потрясли мир
Как все начиналось?
Эта история началась 4 января 1761 г.
По приказу короля датский военный корабль вез из
Копенгагена в Смирну научную экспедицию: трех
ученых, художника, врача и слугу. Одним из
участников был зоолог Форскол. Однажды в начале
марта, когда корабль плыл по Северному морю,
пассажиры заметили в воде странное свечение.
Причиной оказались небольшие, с крупную монету
величиной, медузы, «способные светиться внутри».
Форскол выловил несколько таких медуз и поместил
их в ведро. Если медуз тревожили, они ярко
светились зеленым фосфорическим светом. Форскол
заспиртовал несколько экземпляров медуз и
записал по-латыни в своем походном дневнике: «при
раздражении и гибели светятся». С этой записи
началась история исследований эквореи, как позже
назвали этот род медуз (от лат. aqua – вода).
В изданной посмертно монографии
Форскола «Fauna arabica» (1775) открытая им светящаяся
медуза, которая обитает и в Красном море,
называется Medusa aequorea. Однако позже эту медузу
назвали по имени первооткрывателя.
Через несколько лет после публикации
книги Форскола великий французский химик
Лавуазье показал, что для свечения организмов
необходим кислород: если из-под колпака со
светляками откачать воздух, они перестают
светиться. Так, впрочем, обстоит дело не с любым
свечением организмов. В 1810 г. англичанин
Мак-Кортней повторил эксперимент Лавуазье с
некоторыми кишечнополостными и гребневиками с
биолюминесценцией того же типа, что и у эквореи.
Оказалось, что им для свечения воздух, а
следовательно, и кислород, не нужен.
Через полтора века выяснилось, что
дело обстоит иначе: кислород абсолютно необходим
для предварительной «заправки» эквореи
способным светиться веществом. Вещество же это
оказалось гетероциклическим соединением с
довольно сложной структурой – целентеразином,
производным имидазолпиразина. Целентеразин
окисляется молекулярным кислородом до состояния
гидроперекиси при присоединении к особому
Са-связывающему белку, т.н. экворину.
Молекулярная масса экворина 27 кДа.
Сейчас его широко используют для определения
концентрации внутриклеточного кальция. Еще
более популярным в биологических исследованиях
стал другой белок, так называемый зеленый
флуоресцирующий белок (green fluorescent potein – GFP),
впервые выделенный также из эквореи, но из
другого ее вида – Aequorea victoria. Разговор далее
пойдет о блестящей научной карьере этих и других
близких к ним белков. Однако все по порядку.
Что такое биолюминесценция?
Биолюминесценцией называют свечение
живых организмов, хорошо видимое в темноте
человеком и животными. В настоящее время
известно 700–800 биолюминесцентных видов. В их
числе бактерии, одноклеточные эукариотические
организмы (жгутиконосные водоросли –
динофлагелляты, радиолярии), грибы и подвижные
многоклеточные животные разных типов – от
беспозвоночных (кишечнополостные, гребневики,
черви, моллюски, ракообразные, насекомые и др.)
до рыб (под вопросом одна ящерица с о. Тринидад).
Подавляющее большинство светящихся
существ – обитатели моря, особенно
глубоководные, но есть среди них и наземные
(отдельные виды грибов, земляных червей, улиток,
многоножек и насекомых). Пресноводных
биолюминесцентных видов по не выясненным пока
причинам практически нет, кроме одной
новозеландской улитки и нескольких видов
бактерий.
Колонии бактерий, высшие грибы и
некоторые другие живые существа светятся
непрерывно (статически). Такой свет привлекает
животных, что способствует попаданию бактерий в
нового хозяина и распространению спор грибов.
Однако громадное большинство биолюминесцентных
организмов, включая медузу экворею, генерируют
короткие (0,1–1,0 с) световые вспышки в ответ на
внешние раздражения.
Такие вспышки чаще всего имеют целью
отпугнуть хищников, а также других быстро
движущихся животных, способных механически
повредить субтильный светящийся организм
(медузу, гребневика и т.п.) при случайном
столкновении. В других случаях свет используют
для внутривидовой коммуникации, в том числе
(например, у светляков) – как сигнал,
привлекающий особи другого пола.
Свечение используется с разными
целями. У некоторых глубоководных рыб над ртом
имеется подвижный отросток – «удилище», а на нем
– световая приманка для жертвы, другие рыбы
используют свои светящиеся органы для освещения
ближнего пространства и т.д.
Всего насчитывается больше 30
различных биохимических вариантов
биолюминесценции, независимо возникших в ходе
эволюции у различных организмов.
Как появились биолюминесцентные
системы?
Еще Ч.Дарвин отметил, что
происхождение биолюминесценции не просто
объяснить теорией естественного отбора.
Полезный эффект свечения всецело связан со
зрительным восприятием животных. Следовательно,
повышать шансы выживания может только
биолюминесценция, хорошо заметная в темноте.
Кроме того, если возникают световые вспышки, то
они должны с момента своего появления быть
приурочены ко вполне определенным поведенческим
ситуациям, например, сопровождать двигательную
реакцию, вызванную приближением хищника. Иначе
от свечения никакой пользы не будет.
Здесь нет места постепенному переходу
за счет отбора от так называемого сверхслабого
свечения, свойственного всему живому (но
выявляемого только приборными методами), ко все
более и более яркому излучению, вплоть до хорошо
заметного. Ведь ниже порога видимости не будет
никакого влияния на отбор.
Следовательно, у некоторых
несветящихся видов время от времени случайно
возникают мутанты, ярко светящиеся непрерывно
или при каких-то вполне определенных
обстоятельствах, например, при испуге (что
повышает шансы на выживание). Только так может
начинаться процесс естественного отбора,
приводящего к дальнейшему усовершенствованию
биолюминесцентной системы.
Заметим в этой связи, что у
многоклеточных животных обычно излучает свет не
все тело, а только какая-то определенная
разновидность клеток – так называемые фотоциты,
сгруппированные обычно в специализированные
органы свечения – фотофоры, которые у
некоторых рыб и кальмаров устроены очень сложно.
В ряде случаев эти органы светятся
непрерывно из-за обитающих в них симбиотических
светящихся бактерий. В прочих случаях свечение
импульсное. Оно бывает внутриклеточным или
секреторного типа, когда светящееся вещество
(вернее, комплекс веществ) выбрасывается из
организма и покрывает его светящейся слизью или
образует в воде «световое облако».
Субстраты – люциферины и ферменты –
люциферазы
Еще в 1885 г. французский ученый Дюбуа
показал, что в биолюминесцентной реакции
участвуют термостойкий субстрат, люциферин, и
разрушающийся при нагревании фермент
люцифераза.
Если экстрагировать из
биолюминесцентного организма светящееся
вещество и разделить его раствор на две части,
одну нагреть до 60–100°С, а затем обе части снова
слить, то смесь растворов будет светиться в
присутствии кислорода.
Как мы уже говорили, у разных
организмов субстраты и ферменты, ответственные
за биолюминесценцию, совершенно разные. Названия
их чисто условные. В дальнейшем оказалось, что у
некоторых светящихся организмов за свечение
ответственны стойкие люциферин-люциферазные
комплексы – фотопротеины. В таких комплексах
люциферин временно (до свечения) или даже
постоянно слит в одно целое с люциферазой.
Роль кислорода и антиоксидантное
происхождение биолюминесцентных систем
 Что же служит непосредственной причиной
свечения?
Для свечения всегда необходим
молекулярный (О2) или атомарный кислород. У
восьмиэлектронного атома кислорода имеются,
помимо основного устойчивого состояния,
несколько нестабильных возбужденных состояний.
Переход атомов из возбужденного состояния в
устойчивое сопровождается испусканием фотонов,
правда, инфракрасных. Свечение же организмов
обычно бывает синим или зеленым.
Это достигается суммированием энергий
одновременного перехода из возбужденного
состояния в основное двух или более атомов
кислорода при одновременном разрыве О–О- и
С–С-связей в так называемой диоксетановой
перекиси. Диоксетановая перекись – нестойкое
соединение. Она образуется и тут же распадается в
процессе окислении субстрата – люциферина –
молекулярным кислородом или его так называемыми
активными формами.
Активные формы кислорода (АФК) – это
его анион с одним электроном на внешней орбите
(супероксид), перекись водорода, уже упомянутый
синглетный кислород, гидроксил-радикал и др.
Они играют громадную роль в жизни организмов. АФК
– «полуфабрикат» и «брак» дыхательных
процессов, в которых нормальный конечный продукт
– вода. Опасность АФК связана с их высокой
способностью окислять «что попало» в живом
организме: ДНК и РНК, белки и жиры и т.д.
Для защиты от АФК организмы вынуждены
постоянно потреблять или синтезировать
разнообразные вещества-антиоксиданты (в их числе
витамины С и Е, каротиноиды и т.п.) и ферменты,
из которых главные – супероксиддисмутаза
(преобразователь супероксида в перекись
водорода) и каталаза (преобразует перекись
водорода в воду).
В то же время в умеренных количествах
АФК необходимы для жизнедеятельности любого
организма и образуются посредством специальных
ферментов (НАДФ.Н-оксидазы и др.). АФК
секретируются белыми кровяными тельцами для
уничтожения микробов. Кроме того, они участвуют в
регуляции клеточного деления, в запуске
«запрограммированной смерти» клеток – апоптоза,
в управлении тонусом кровеносных сосудов и во
многих других жизненно важных процессах.
Мы специально затронули этот сложный
вопрос потому, что работы последних лет показали:
практически любой люциферин и многие люциферазы
имели «добиолюминесцентную» функцию защиты
организма от АФК. Эти субстраты и ферменты
продолжают выполнять эту функцию у ближайших
несветящихся родичей биолюминесцентных
организмов. Достаточно оказалось одной малой
«поломки» исходной (окислительной) реакции,
чтобы в ходе ее появилось хорошо заметное
свечение. Возник новый признак –
биолюминесценция. Его закрепил естественный
отбор. Пока природой таких предполагаемых нами
мутаций никто специально не занимался. Само их
обнаружение – дело будущего.
Активируемые кальцием фотопротеины
Вернемся, однако, к экворее. В
1961–1962 гг. американские ученые Джонсон и
Шимомура выделили из нее уже упомянутый белок
экворин. Оказалось, он светится в присутствии
ионов кальция (а также некоторых других
двухвалентных катионов, но не магния, который это
свечение ослабляет).
Позже нашли такие же белки в
колониальных гидрополипах Obelia longissima и O.geniculata,
гребневиках, радиоляриях.
Во всех случаях оказалось, что
светится комплекс люциферазы с перекисью
предварительно присоединенного к ней и ею же
окисленного люциферина. Последний у всех
вышеупомянутых организмов – целентеразин. В
момент присоединения ионов кальция к люциферазе,
которая в данном случае относится к числу так
называемых кальций-связывающих белков,
пространственная структура (конформация) этого
белка изменяется так, что он утрачивает связь с
перекисью люциферина. Перекись при этом теряет
стабильность и превращается в окисел, попутно
отделяя СО2 и испуская синий свет.
Яркость такого свечения достаточно
велика, поэтому вскоре после выделения экворина
родилась идея использовать этот белок и другие
ему подобные (например, обелин) как индикаторы
свободных ионов кальция во всевозможных клетках.
В 1967 г. английские ученые Эшли и
Риджуэй с помощью стеклянного микроэлектрода
впрыснули экворин в гигантское мышечное волокно
морского желудя (сидячего морского
ракообразного). Использованная установка
позволяла одновременно регистрировать
мембранный потенциал клетки, ее свечение,
создаваемое впрыснутым экворином, и натяжение.
Так обнаружили, что именно ионы кальция,
цитоплазматическая концентрация которых
повышается в 10 и более раз при электрическом
раздражении клетки, запускают мышечное
сокращение.
В дальнейшем сотни новых работ
показали, что ионы кальция запускают самые
разные клеточные процессы: мышечные и немышечные
сокращения, выброс нейромедиаторов в
синаптическую щель, всевозможные виды секреции
и т.д. Были созданы новые флуоресцирующие
индикаторы Са2+ и других ионов, проникающие, в
отличие от светящихся белков, сквозь клеточную
мембрану. Однако начало этой новой эре положили,
несомненно, светящиеся белки экворин и обелин.
В дальнейшем гены этих белков выделили
и клонировали в кишечной палочке E.coli. Затем
были созданы трансгены кукурузы, клеток
млекопитающих в культуре и т.д., постоянно
синтезирующие апопротеин (безлюцифериновую
часть) экворина и обелина. Достаточно было
добавить к таким организмам целентеразин, чтобы
наблюдать в хроническом опыте за свечением,
отражающим изменения концентрации ионов кальция
в цитоплазме. Подобные эксперименты
продолжаются и в настоящее время.
Зеленый флуоресцирующий белок GFP
Еще Джонсон и Шимомура, выделяя
экворин, отметили, что живая экворея светится
зеленым светом с максимумом интенсивности при
длине волны 508 нм. Между тем выделенный экворин
излучает синий свет с максимумом при 465 нм. В
чем причина?
Биолюминесцентные ткани медузы при
солнечном свете, а также при искусственном
освещении ультрафиолетом или синим светом
отсвечивают зеленым. Это вызвано тем, что в
фотогенных тканях медузы кроме экворина
присутствует и другой белок. Он сам не способен
испускать свет, а только флуоресцирует, если
освещать его синим или ультрафиолетовым светом.
Возбуждаясь под действием этих излучений, он
испускает более длинноволновый зеленый свет. За
это свойство белок назвали зеленым
флуоресцирующим белком (GFP).
Позже другие исследователи, Гастингс и
Морин, нашли GFP у ряда светящихся представителей
двух классов кишечнополостных животных –
гидроидов (Aequorea, Obelia и др.) и кораллов
(морское перо Renilla). Если судить по цвету
флуоресценции фотогенных клеток, подобный же
белок может иметься и у гребневиков Bolinopsis. У
гидроидов и кораллов люциферазы совершенно
разные. Гребневики, подобно гидроидам, имеют
активируемую Са2+ биолюминесцентную
систему.
Все три группы беспозвоночных
разделились более полумиллиарда лет тому назад и
едва ли унаследовали от общих предков свои
биолиминесцентные системы. Скорее уж в каждой
группе способность светиться появилась
независимо и намного позже их разделения. Это
связано с поведенческой функцией
биолюминесценции: отпугивать в темноте
высокоподвижных животных с хорошо развитым
зрением. В докембрии такие животные еще не
появились.
Такое запаздывание появления
биолюминесценции в ходе эволюции наводит на
мысль, что GFP унаследованы гидроидами и
кораллами, а также и теми гребневиками, у которых,
возможно, есть подобный же белок, от их общих
небиолюминесцентных предков. Эта догадка в конце
концов и привела нас к открытию нового семейства
разноцветных белков – гомологов GFP у
несветящихся кораллов. Но об этом чуть позже.
При изучении GFP удалось обнаружить ряд
совершенно уникальных свойств. Многое пока не
поддается объяснению. Так, невозможно
представить себе веревку, которая сама собой
постепенно свивается в гордиев узел. Однако
подобное происходит со многими белками после их
синтеза на рибосомах. GFP в этом отношении
побивает все рекорды.
Третичная структура его удивительно
сложна. Это подобие бочки или клетки с
одиннадцатью так называемыми
бета-складками – завернутыми винтом
вертикальными прутьями. «Дно» и «крышку»
образуют альфа-спиральные участки того же самого
белка.
Внутри столь сложной конструкции, как
попугай в клетке, заключена флюорофорная часть.
Она образуется самой же полипептидной цепью в
результате дегидрогенизации (отнятия двух
атомов водорода) и окисления молекулярным
кислородом остатка аминокислоты тирозина.
Окисленный тирозин реагирует с другой
аминокислотой в той же цепи – глицином. Вот и
готова излучающая часть молекулы, ее
флуорофорное кольцо. Оно способно поглощать
«ультрафиолетовые» или «синие» фотоны и
испускать в обмен фотоны с меньшей энергией,
соответствующие сине-зеленому свету.
Эффективность передачи энергии в такой системе
(квантовый выход) поразительно высока –
около 0,8. Иными словами, только 20% поглощенной
GFP световой энергии теряется (переходит в тепло),
а остальные 80% преобразуются в излучаемый
видимый свет.
GFP A.victoria клонировали в 1992 г. и
сразу же начали применять как генетическую
метку, соединяя ген GFP воедино с генами других
белков или вводить мРНК GFP во всевозможные
клетки. Стало ясно, что таким способом можно
сделать видимыми в люминесцентный микроскоп
места и темп образования белков, закодированных
в любых других генах, прослеживать рост
клеточных клонов, включая патогенные бактерии и
раковые клетки, а также наблюдать за
размножением в подопытном организме
всевозможных вирусов. В числе этих последних
могут быть ретровирусы, внедряющие свои ДНК в
геном хозяина, как, например, это делают вирусы
гепатита и ВИЧ.
К 2000 г. общее число работ с
применением GFP как генетического маркера
превысило 6000. В последнее время этот маркер стали
применять в комплексе с геном белка нестина,
характерного для стволовых нервных и других
клеток. Этот метод помог опровергнуть догму о
невосполнимости во взрослом организме нейронов
мозга. Оказалось, что их самообновление за счет
дифференцирующихся стволовых клеток
осуществляется даже у взрослых животных и
человека. Новые нервные ассоциации, например,
обучение новой песне у самца канарейки, влекут за
собой включение вновь дифференцировавшихся
нейронов в ранее сложившийся «мозговой
коллектив»!
Между тем появилась необходимость
обогатить палитру применяемых цветных маркеров,
чтобы можно было в одном опыте метить более чем
один ген. Попытки добиться этого эффекта через
мутации гена «зеленого белка» эквореи,
пересаженного в кишечную палочку, почти ничего
не дали: от исходного дикого типа были получены
слабосветящийся «голубой» и «красный» мутанты.
Прогресс в этом вопросе тормозило
сложившееся убеждение, что все зеленые
флуоресцирующие белки обязательно встроены в
биолюминесцентные системы гидроидных полипов
либо кораллов как преобразователи синего света
биолюминесценции во вторичный, зеленый. Мысль о
том, что подобные же белки могут функционировать
совсем в иных качествах, выполняя совершенно
другие функции, и быть при этом вовсе не
обязательно «зелеными» и «флуоресцирующими»,
долго никому не приходила в голову.
Нас на эту мысль натолкнули уже
упомянутые выше соображения о разнице в
эволюционном времени разделения гидроидов,
кораллов, гребневиков и куда более позднем
появлении биолюминесценции у отдельных
представителей этих групп животных. Другой
наводящей информацией стала яркая зеленая
флуоресценция ряда вовсе не биолюминесцирующих
кораллов и актиний, почти такая же, как у
фотогенных клеток биолюминесцентных видов.
Особенно бросилась в глаза такая зеленая
флуоресценция кончиков щупалец у тихоокеанской
актинии Anemonia majano, жившей в морском аквариуме
у московского любителя Андрея Романько. У другой
актиниии из того же рода, Anemonia sulcata, кончики
щупалец были красные.
До нас полагали, что за такую
флуоресценцию и окраску кораллов ответственны
какие-то низкомолекулярные пигментные
соединения, выполняющие в основном две функции. У
животных, обитающих в ярко освещаемой солнцем
поверхностной части рифа, такие пигментные
соединения могли бы выполнять светозащитную
функцию. У кораллов же, обитающих на большой
глубине, функция флуоресценции могла играть
другую роль. Значительную часть пищи кораллов
составляют продукты фотосинтеза обитающих в их
тканях симбиотических водорослей.
Предполагалось, что флуоресцирующий пигмент
кораллов позволяет им использовать для
фотосинтеза синий свет морских глубин,
преобразуя его в более длинноволновые излучения,
поглощаемые хлорофиллом симбионтов.
Первая же попытка выявить
молекулярно-генетическими методами присутствие
в щупальцах актиний белков, более или менее
похожих на GFP A.victoria, завершилась полным
успехом. Гены, выделенные и пересаженные в
кишечную палочку, привели к синтезу в ней белков,
аминокислотные последовательности которых на
20–30% совпадают с GFP A.victoria. Для организмов,
предки которых разделились в докембрии, т.е.
более 0,5 млрд лет тому назад, такая степень
близости считается очень большой.
Первый из выделенных белков и в
бактериях флуоресцирует в сине-зеленой области.
Второй белок окрасил клетки бактерий в
малиново-красный цвет и оказался (до получения
его мутантов) почти не флуоресцирующим.
После первых удач началась «охота» за все
новыми разновидностями подобных же белков из
всевозможных небиолюминесцентных видов –
мягких и мадрепоровых кораллов, а также актиний,
разводимых в морских аквариумах Московского
зоопарка или московских любителей. К настоящему
времени таким способом идентифицированы и
клонированы в бактериях 26 разных GFP-подобных
белков, флуоресцирующих во всевозможных частях
видимого спектра, от сине-зеленой до
рубиново-красной, или же вообще не
флуоресцирующих, а окрашенных во всевозможные
цвета. Значение этой находки для современной
молекулярной биологии, биотехнологии,
экспериментальной медицины трудно переоценить.
|