Е.В. ПИМЕНОВ, В.В. КОЖУХОВ, Ю.И. СТРОЧКОВ

Создание вакцин против сибирской язвы

О сибирской язве, которая относится к числу особо опасных инфекций, наслышаны сейчас многие. Эта болезнь, поражающая сельскохозяйственных животных – крупный и мелкий рогатый скот, лошадей, ослов, верблюдов, – все еще остается бичом для многих стран и приносит большой экономический ущерб. Болеют ею и дикие млекопитающие (травоядные, хищные, а также всеядные кабаны). Высокая заболеваемость обусловлена тем, что возбудитель сибирской язвы способен больше 100 лет сохраняться в почве в виде спор и образовывать стойкие очаги инфекции. Существование таких очагов в разных регионах мира, в том числе на территории России, создает постоянную угрозу эпизоотий и эпидемических вспышек среди людей, которым инфекция передается от скота. По данным Всемирной организации здравоохранения, в мире ежегодно заболевают около 20 тыс. человек, при этом нередок летальный исход.

В России выявлено более 72 тыс. очагов, но есть очаги, которые не всегда поддаются учету. Это, например, скотомогильники. Именно они ответственны за возросшее в последние годы поступление возбудителя сибирской язвы в природную среду. В настоящее время отмечается активизация многих очагов, и Государственный комитет санитарно-эпидемиологического надзора (Госкомсанэпиднадзор) оценивает эпидемическую обстановку по сибирской язве как напряженную.

Как предотвратить эту болезнь? Одного только соблюдения санитарных норм для этого недостаточно, поэтому для профилактики используются вакцины. В нашей стране до недавнего времени применяли живые споры ослабленных штаммов возбудителя, за рубежом – в основном химическую вакцину. Хотя такая профилактика дает надежный эффект, вакцинные препараты продолжают совершенствоваться. О современных подходах к их созданию и пойдет речь в статье.

Бацилла и ее оружие

Сибиреязвенная бацилла (Bacillus anthracis) – это крупная (длиной 6–10 мкм и диаметром 1–1,5 мкм) аэробная грамположительная неподвижная палочка. Она может существовать в двух формах – вегетативной и покоящейся.

Рис 1. Одиночные вегетативные клетки сибиреязвенной бактерии. Каждая клетка заключена в плотную оболочку, называемую клеточной стенкой, под которой находится цитоплазматическая мембрана. Большую часть объема клетки занимает бактериальный аналог ядра эукариотических организмов – нуклеоид, содержащий генетический материал

Вегетативная клетка окружена капсулой и одета плотной оболочкой, под которой находится цитоплазматическая мембрана, а внутри цитоплазмы – нуклеоид (аналог ядра) и рибосомы. Размножается эта форма простым поперечным делением, но дочерние клетки не расходятся, а остаются соединенными. При дальнейших делениях образуется цепочка из нескольких вегетативных клеток, каждая из которых заключена в капсулу.

Внутри клеток такой колонии и формируется покоящаяся форма бациллы – спора. Схематически это происходит следующим образом. Сначала удваивается и делится пополам нуклеоид, новые аналоги ядра перемещаются к полюсам клетки, а внутри нее возникает поперечная перетяжка из цитоплазматической мембраны. Затем около одного из полюсов мембрана впячивается и обволакивает нуклеоид. Образуется проспора, окруженная двойной мембраной.

На этой стадии бацилла представляет собой своеобразный двуклеточный организм – материнскую клетку с проспорой внутри. Постепенно она превращается в зрелую спору, защищенную от внешних воздействий кортексом и мощной оболочкой. После этого материнская клетка разрушается и спора освобождается. В благоприятных условиях она прорастает – сбрасывает «защитную одежду» и становится вегетативной клеткой.

В организм млекопитающего, и человека в том числе, бацилла попадает контактным путем. Животные в течение всей болезни выделяют бациллу с мочой, фекалиями, мокротой, слюной, молоком, поэтому заразны не только продукты животноводства, но и предметы ухода за скотом, навоз. Человек может заразиться, соприкасаясь с больным животным или его трупом, при убое или разделке туши, кулинарной обработке мяса, манипуляциях с обсемененным возбудителем сырьем (кожей, овчиной, шерстью) и изделиями из него, нарушении режима работы в лаборатории.

Известны случаи, когда бацилла попадала в организм с пищей, через укусы слепней и мух-жигалок, воздушно-пылевым путем во время обработки шерсти на овчинно-шубных производствах. Возбудитель способен проникать в организм человека через повреждения кожных покровов, и тогда развивается кожная форма болезни (видимо, из-за этой формы сибирская язва известна и под другим названием – злокачественный карбункул). Если воротами инфекции служат слизистые оболочки, например, кишечный тракт или дыхательные пути, болезнь принимает более опасную форму – висцеральную. Протекает она тяжело и скоротечно, может развиться сепсис, за которым в 13% случаев следует смерть.

В почве бактерия находится обычно в виде спор, очень устойчивых к колебаниям температуры, влажности, давлению, солнечному свету и т.д. и потому сохраняющих жизнеспособность длительное время. Если условия в почве благоприятны, споры прорастают, приводя к накоплению в ней вегетативной формы возбудителя.

В организм диких и домашних животных могут попасть споры, которые затем прорастают с образованием вегетативной формы. В таком виде B.anthracis и существует в тканях, и передается от больного к здоровому. Достаточно небольшого числа спор или вегетативных клеток, попавших тем или иным способом в организм, чтобы бактерия размножилась в тканевой жидкости и макрофагах. При этом она выделяет экзотоксин и капсульную субстанцию – вещества, поражающие клетку. Дополнительно к ним бактерия продуцирует еще и экзопротеазы – ферменты, расщепляющие белки организма-хозяина.

Экзотоксин представляет собой белковую молекулу, состоящую из трех субъединиц: протективного антигена, отечного и летального факторов («факторами» называют субъединицы, а их названия даны по характеру действия на лабораторных животных). В молекуле токсина протективный антиген играет транспортную роль: сначала соединяется со специфическим клеточным рецептором, потом активируется за счет гидролиза и в результате обретает способность образовывать мембранные каналы, чем и обеспечивает перенос двух других субъединиц – отечного и летального факторов – в клетку организма-хозяина. Там эти, по сути самостоятельные, токсины и осуществляют свое цитотоксическое действие: вместе с экзопротеазами вызывают резкие нарушения клеточного обмена, приводя к деградации и гибели клетки. В организме больного протективный антиген стимулирует образование антител, которые предотвращают последующее заражение высоковирулентными штаммами бактерий.

Агрессивность микроба в организме в большой степени обусловлена капсульной субстанцией, которая представляет собой полимер D-глутаминовой кислоты. Именно капсула ингибирует фагоцитоз, предотвращая гибель бациллы, защищает ее от бактерицидного действия лимфы и крови.

Многочисленные исследования убедительно показали, что вирулентность возбудителя сибирской язвы, утратившего способность образовывать капсулу, снижается в десятки тысяч раз, хотя его способность вызывать иммунитет сохраняется. Это послужило основой для разработки в конце 1930-х – начале 1940-х гг. живых споровых вакцин на основе штаммов, не имеющих капсулы, но вырабатывающих токсин.

Генетический аппарат сибиреязвенного микроба состоит из хромосомы и двух плазмид (pXO1 и рХО2) – внехромосомных элементов, открытых в начале 80-х гг. и очень важных для проявления вирулентности и иммуногенности. Плазмида pXO1 содержит три гена экзотоксина – pag, lef и суа. Первый из них кодирует синтез протективного антигена, второй – летального фактора, третий – отечного фактора. В pXO1 имеются также гены регуляторов синтеза этих продуктов. Плазмида рХО2 содержит наиболее значимые гены, определяющие синтез капсулы. К настоящему времени полностью расшифрована нуклеотидная последовательность первой плазмиды и значительная часть второй. Благодаря этому существенно расширились возможности генетических манипуляций с бациллой.

В генетическом отношении она оказалась одним из наиболее однородных микроорганизмов, что во многом связано со способностью бациллы образовывать споры. Различия между ее штаммами сводятся к наличию или отсутствию плазмид или вариабельности их структуры.

Современная защита

Чтобы предотвратить развитие в организме млекопитающего сибиреязвенной бактерии, сейчас используют вакцины четырех типов: живую, химическую (молекулярную), комбинированную и рекомбинантную.

Живая вакцина – это лиофильно высушенные споры эталонного, специально выращенного штамма B.anthracis. Химическая вакцина кардинально отличается от живой тем, что представляет собой адсорбированный на носителе протективный антиген (т.е. лишь одну белковую молекулу), который получают в процессе культивирования вакцинного штамма.

Обе вакцины обеспечивают формирование как гуморального, так и клеточного иммунитета, но химический препарат вызывает иммунный ответ быстрее (через несколько дней), однако гуморальная защита быстро угасает. Комбинированные вакцины готовят на основе спор и протективного антигена, а рекомбинантные создают с помощью генно-инженерной технологии, встраивая фрагменты ДНК, ответственные за синтез антигенов B.anthracis, в генетический аппарат того или иного вектора или продуцента, т.е. специально подобранных для этой цели вирусов или бактерий.

В СССР профилактическим средством против сибирской язвы служила живая вакцина, которую производили в Грузии. После распада Советского Союза поставки вакцины в Россию прекратились, и в 1990–1993 гг. плановые ревакцинации не проводились. По данным Госсанэпиднадзора, заболеваемость сибирской язвой в 1992–1993 гг. увеличилась в 2 раза по сравнению с концом 1980-х гг. Остро встала проблема производства профилактических средств борьбы с сибирской язвой.

Основа для этого уже существовала. Еще в 1980-х гг. в бывшем Свердловске, в Центре научно-технических проблем биологической защиты Научно-исследовательского института микробиологии Министерства обороны, была разработана жидкая комбинированная вакцина. Занимались сибиреязвенной вакциной и в самом институте. В результате в 1990-х гг. была создана не имеющая аналогов сухая форма комбинированной вакцины, состоящей из живых спор ослабленного штамма и протективного антигена, сорбированного на геле гидроксида алюминия.

Комбинированная вакцина по сравнению с живой обладает более выраженным защитным эффектом, причем иммунитет не только развивается быстрее, но и дольше сохраняется благодаря наличию в организме клеток ослабленного штамма бактерии. Безвредность и реактогенность, т.е. способность вызывать местные и общие реакции организма, у этих вакцин существенно не отличаются.

Сравнение отечественных комбинированных вакцин с американской химической – не в пользу последней по многим характеристикам. Чтобы создать устойчивый иммунитет, используя химическую вакцину, нужна длительная многократная иммунизация, а это чревато возникновением аллергической реакции. Кроме того, такая вакцина защищает не от всех вирулентных штаммов B.anthracis. Например, после трехкратного введения химической вакцины только у 17–33% подопытных морских свинок развивается иммунитет против любого из четырех штаммов (Ames, NH, FCB, SK162), в то время как живая споровая вакцина обеспечивает полную защиту. Среди других преимуществ отечественных вакцин – больший срок годности, менее жесткие условия хранения и транспортировки.

Эти вакцины уже лицензированы, НИИ микробиологии Минобороны РФ получил сертификаты на производство и живой, и комбинированной сибиреязвенных вакцин. Иммуногенность и стабильность вакцинного препарата по сравнению с выпускавшимся в Грузии повысились в 5–10 раз. Создатели новой технологии серийного производства вакцины в 1998 г. были удостоены премии правительства РФ.

С конца 1993 г. произведено 25 млн доз вакцины, и потребности в ней отечественных медицинских учреждений полностью удовлетворены. По данным Госкомсанэпиднадзора, в результате иммунизации населения этой вакциной в середине 1990-х гг. уровень заболеваемости сибирской язвой снизился: в 1994 г. число заболевших уменьшилось примерно на 46% по сравнению с 1992 г., а в 1995 г. – на 23% по сравнению с 1994 г.

Прототипы вакцин будущего

Несмотря на эффективность существующих вакцин, специалисты ищут способы их усовершенствования. Цель поисков – увеличить длительность иммунитета, повысить уровень продукции протективного антигена, снизить общие (например, повышение температуры) и местные реакции, возникающие в ответ на действие летального и отечного факторов. Достичь ее можно методами генной инженерии, т.е. манипулируя генами плазмид pXO1 (pag, lefa суа) и рХО2.

Исследования ведутся в ряде лабораторий мира в нескольких направлениях. Одно из них – конструирование рекомбинантных штаммов, продуцирующих протективный антиген. Для этого ген pag внедряют в геном других микроорганизмов – Bacillus subtilis или B.brevis, часто используемых в биотехнологии бактерий, которые затем синтезируют защитный антиген, причем в больших количествах, чем сама сибиреязвенная бацилла. Однако исследователям пока не удалось добиться устойчивого результата, так как ДНК B.anthracis далеко не всегда сохраняет свою устойчивость в чужих геномах.

По мнению некоторых исследователей, предпочтительнее конструировать продуценты, которые синтезировали бы не всю субъединицу протективного антигена, а только ее иммуногенные эпитопы – небольшие гидрофильные фрагменты молекулы, которые взаимодействуют с антителом и обеспечивают клеточный иммунитет. Для этого в геном бактерии-продуцента необходимо вставить лишь ту часть гена pag, которая кодирует эти эпитопы. Возражения против этого подхода основывались на том, что именно эта часть генома считалась наиболее изменчивой у вакцинных штаммов B.anthracis.

Рис. 2. Схема строения плазмид pXO1 и рХО2. Гены первой плазмиды в основном ответственны за синтез субъединиц экзотоксина: отечного фактора (ген суа), протективного антигена (pag) и летального фактора (lef). Во второй плазмиде содержится целый кластер генов (сарА, сарС и сарВ), обеспечивающих образование капсулы, т.е. полимеризацию D-глутаминовой кислоты. Из других плазмидных генов на схеме показано положение только тех, которые управляют синтезом. В pXO1 – это положительный регулятор синтеза экзотоксина (atxA), отрицательный регулятор синтеза протективного антигена (pagR) и группа генов, обеспечивающих прорастание спор (ger); в рХО2 – положительный регулятор синтеза D-глутаминовой кислоты (асрА) и дублированный (atxA), а также ген, ограничивающий полимеризацию капсульной субстанции (dep). На схеме соблюдены размерная пропорция генов и их расположение в кольцевой структуре каждой плазмиды

Однако наши исследования показали, что это не так. В последовательностях из примерно 800 нуклеотидов в предположительно наиболее изменчивом участке гена pag у трех вакцинных штаммов (СТИ-1, 55 и второй вакцины Ценковского) по сравнению с известной последовательностью штамма Sterne обнаружено всего две замены. Это означает, что ген pag весьма консервативен.

Некоторые исследователи предлагают повысить иммуногенность сибиреязвенных вакцинных штаммов введением в них дополнительных чужеродных генетических фрагментов, например гена белка А-стафилококка. Однако подобные варианты вакцин вызывают аллергические реакции, а сами штаммы-продуценты оказываются генетически нестабильными.

Известно, что химические вакцины обеспечивают защиту не от всех штаммов B.anthracis, в то время как перенесенная инфекция дает стойкий иммунитет. Поэтому некоторые специалисты предлагают повысить иммуногенность рекомбинантных вакцин, используя для их создания бактерии B.subtilis, производящие капсульные полипептиды B.anthracis.

Второе направление в совершенствовании вакцин связано с созданием рекомбинантных штаммов, которые вызывали бы длительный иммунитет. Для этого пригодны вакцинные штаммы возбудителей особо опасных инфекций, способные долго сохраняться в организме и тем самым поддерживать стойкий иммунитет. Если в такие штаммы ввести ген протективного антигена, цель будет достигнута. Это перспективное направление позволит создать поливалентные вакцины, т.е. профилактические средства сразу против нескольких особо опасных инфекций. В последние годы удалось внедрить ген pag в разные штаммы лактобацилл, обладающих адъювантными (усиливающими иммунный ответ) свойствами, а значит, появилась возможность создавать вакцины для перорального применения.

Рис. 4. Цепочка вегетативных клеток сибиреязвенной бактерии

Третье направление в повышении эффективности сибиреязвенных вакцин основывается на применении новых адъювантных технологий, белковой инженерии и иммуномодуляции. Для этого пригодны вакцинные препараты, лишенные балластных веществ (т.е. всего того, что не имеет отношения к выработке иммунитета). Повышение иммуногенности достигается традиционными путями: за счет полимеризации молекул антигена, закрепления его на минеральном или полимерном сорбенте. Известно, что сорбенты повышают иммуногенность белковых антигенов в десятки и сотни раз. Иными словами, речь идет об адъювантных, сорбированных препаратах, или, как их иногда называют, полусинтетических вакцинах.

Очень эффективную вакцину создал Б.Ивинс с коллегами для пероральной профилактики свиней, заразившихся спорами B.anthracis. Она состоит из протективного антигена и адъювантов: сапонина QS-21 и монофосфориллипида А в эмульсии поверхностно-активного вещества твина-80. В экспериментах этот препарат проявил себя много лучше, чем используемые в таких случаях английская или американская вакцины.

Надо сказать, что получение протективного антигена в процессе культивирования производящих его бактерий связано с одной неприятностью: антиген легко разрушается протеазами, из-за чего выработка его снижается. Этого можно избежать, если модифицировать антиген методами белковой инженерии – удалить из молекулы те участки, по которым его расщепляют протеазы.

Что же касается полимеризации протективного антигена, то ее пытаются добиться дупликацией иммунологически значимых эпитопов или модификацией антигена, которая приводила бы к образованию нескольких этих фрагментов с формированием ими четвертичной структуры. Такие молекулы протективного антигена усиливают защитные свойства вакцин.

В настоящее время экспериментально доказана возможность повысить эффективность и живых сибиреязвенных вакцин, если вторичную иммунизацию проводить препаратами, которые содержат протективный антиген, и применить усиливающие иммунный ответ организма иммуномодуляторы, например сальмозан.

В последние годы в ряде лабораторий разрабатывается четвертое направление в создании сибиреязвенных вакцин. Основано оно на конструировании штаммов возбудителя со структурно измененными генами токсинов. Исходными вариантами служат штаммы B.anthracis только с одной плазмидой pXO1. При удалении из генов lef и суа определенных участков цитотоксическая активность бактерий сильно снижается, а преимущества живых вакцин сохраняются. Есть и другая возможность – проанализировать ДНК клонов бактерий с помощью полимеразной цепной реакции и найти среди них варианты без генов lef и суа.

Недавно в НИИ микробиологии Минобороны РФ закончено исследование влияния мутаций в генах pag и lef на иммуногенность и вирулентность вакцинных штаммов. Выяснилось, что лишь обширное повреждение в концевой части гена pag приводит к потере биологических свойств, а отсутствие примерно 600 пар нуклеотидов не сказывается никак. В то же время утрата сравнительно небольшого числа нуклеотидов (около 150 пар) в центральной области гена значительно снижает иммуногенность штамма. Если же дефектен ген lef, a pag не изменен, то вирулентность существенно снижается, но иммуногенность сохраняется (или уменьшается незначительно). Так что поиск вариантов сибиреязвенной бациллы с дефектными генами токсинов отнюдь не бесполезен.

Рис. 3. Сроки возникновения и сохранения иммунитета, развивающегося у лабораторных животных при введении сибиреязвенных вакцин. Защитный эффект рассчитан как относительное количество выживших животных, которых после иммунизации заражали 100 дозами ЛД50 возбудителя

К середине 1990-х гг. сформировалось еще одно направление профилактики заболеваний сибирской язвой – ДНК-вакцинация. Этот принципиально новый подход основан на способности нуклеиновых кислот существовать несколько недель и даже месяцев в цитоплазме клеток организма-хозяина, не встраиваясь в его геном, но поддерживая синтез закодированных в них белков. Следовательно, если в профилактических целях иммунизировать человека, например, фрагментом гена pag, то в его клетках будет синтезироваться эпитоп протективного антигена, который и вызовет иммунный ответ. Такая вакцинация может быть предпочтительной для людей, страдающих аллергией.

С ДНК-вакцинацией, развивающейся огромными темпами, связывают надежды на профилактику и лечение многих заболеваний, в том числе и особо опасных инфекций. Сегодня экспериментально подтверждена ее эффективность в создании полноценного иммунитета не только к вирусам гепатита, гриппа и др., но и к возбудителям сальмонеллеза, туберкулеза, коклюша, а также сибирской язвы. Некоторые ДНК-вакцины уже проходят клинические испытания. Все это позволяет утверждать, что одним из главных направлений развития медицины XXI в. станет вакцинация генами.

Специалисты разного профиля продолжают поиск по созданию безопасных и высокоиммунных вакцин. Видимо, уже в ближайшие годы станет ясно, какое из развивающихся направлений даст лучшие результаты и позволит предотвратить эпизоотии и распространение сибирской язвы среди людей.

По материалам журнала «Природа», № 10/2000.