Путешествие в невидимый мир

«Укрощение строптивых»

Во время нашего путешествия в микромир вы о вирусах доброго слова не услышали. Действительно, они – враги всего живого. Но нельзя ли врагов превратить в друзей?

Первые опыты по «приручению» вирусов были поставлены на фагах – «пожирателях» бактерий. При встрече с вирусами бактерии «тают» на глазах. Вот эту способность фагов и решили использовать для предупреждения и лечения инфекционных болезней.

Но оказалось, что в организме человека фаги не так быстро и активно расправляются с бактериями, как в пробирке. Мало того, бактерии не так уж «глупы» – они быстро становятся нечувствительными к действию фагов.

Частицы вируса лейкоза птиц в клетке куриного эмбриона

После появления антибиотиков использование фагов в борьбе с инфекционными заболеваниями стало и вовсе нецелесообразным. Способность фагов лизировать (растворять) только определенные бактерии стали применять для диагностики. Бактерии, выделенные из организма больного, выращивают на питательной среде в чашках Петри. Затем вносят туда фаги разных бактерий (холерных, дизентерийных, брюшнотифозных и т.п.), а через сутки, просматривая чашки на свет, легко определить, какой фаг вызвал растворение бактерий, т.е. определить и возбудителя болезни. Однако более точные данные, притом гораздо быстрее, получают с помощью иммунохимических методов.

Но не только фаги могут быть полезны человеку. Так, в Австралии в середине 1960-х гг. сельскому хозяйству большой ущерб наносили сильно размножившиеся дикие кролики. Отстрел кроликов оказался неэффективным. Тогда ученые применили «летающие смертоносные иглы» – комаров, «начиненных» болезнетворным вирусом. Этот вирус был безвреден для человека, а кролики были уничтожены.

Гусеницы и жуки-пилильщики наносят ущерб сельскому хозяйству не меньший, чем кролики. В борьбе с ними ученые использовали вирусы полиэдроза и гранулоза насекомых. В Калифорнии (США) при борьбе с гусеницами на полях люцерны и в Канаде при уничтожении соснового пилильщика эти вирусы распыляли с самолетов. Поля и леса были спасены.

Но вирусы могут «воевать» и друг с другом.

Интерферон

Еще в начале XIX в. Дженнер, наблюдая за действием противооспенных прививок, обратил внимание на загадочный факт: больные герпесом были невосприимчивы к вакцине против оспы. Позже сходное явление было установлено для вируса желтой лихорадки. В природе существует две разновидности этого вируса: один вызывает легкую форму, другой – тяжелую. Опыты на обезьянах показали, что при введении сначала первого вируса, а затем второго животные остаются здоровыми. Контрольные обезьяны, которым вводили только второй вирус, все погибали.

Такое антагонистическое взаимодействие между вирусами ученые назвали интерференцией. Опыты по интерференции вирусов проводили на обезьянах, кроликах, морских свинках, мышах, крысах с самыми разными вирусами. Оказалось, например, что вирус оспы может интерферировать с вирусом ящура, а вирус гриппа – с вирусом желтой лихорадки.

Затем выяснилось, что не все вирусы интерферируют друг с другом. Например, если обезьяне, чувствительной к полиомиелиту, ввести вирус чумы собак, а затем заразить полиомиелитом, то она не заболеет. Если же обезьяне ввести вирус оспы, а затем полиомиелита, то животное заболеет полиомиелитом и погибнет.

Поиски безопасных для человека вирусов, которые могли бы интерферировать с болезнетворными вирусами, привели к важному открытию. Оказалось, что не только живые, но и убитые вирусы могут интерферировать с живыми.

Со временем число известных пар взаимно несовместимых вирусов росло, но механизм интерференции оставался неизвестным. Только в 1957 г. английские ученые А.Айзекс и Ж.Линденман открыли образование в клетках при вирусных инфекциях особого вещества, защищающего клетки от вирусов. Вспомним, в то время разразилась пандемия азиатского гриппа. Айзекс и Линденман в поисках эффективных средств защиты от заболевания обнаружили, что с вирусом гриппа интерферирует культуральная среда. Оказалось, что интерференция вызвана низкомолекулярным белком, вырабатываемым клетками при взаимодействии с вирусом. Это вещество назвали интерфероном.

В середине 1960-х гг. ученые установили, что многие клетки позвоночных, включая человека, могут производить интерферон сами по себе, но обычно синтез интерферона включается в ответ на вирусную инфекцию, химические воздействия, а также при иммунных реакциях. Обычно интерферон видоспецифичен, т.е. активен только в тех организмах, из которых получен. Стимуляцию синтеза интерферона вызывает попадание в клетку чужеродной нуклеиновой кислоты (ДНК или двухцепочечной РНК), вирусов, а также воздействие некоторых веществ.

Когда интерферон был открыт, считалось, что это одно вещество. Позже было показано, что разные клетки организма синтезируют разные виды интерферона, которые принято обозначать греческими буквами: a, b, g. Все виды интерферона – белки с молекулярной массой 25–100 кДа.

Интерфероны замедляют размножение многих вирусов, хотя и не всех. По характеру действия интерфероны разделяют на два типа: I и II. К типу II относится только g-интерферон (или интерлейкин), который производят только Т-хелперы и так называемые естественные киллеры (клетки крови, возможно, родственники лимфоцитов). Этот интерферон значительно повышает активность макрофагов и естественных киллеров, которые атакуют как чужеродные клетки, так и клетки с какими-то нарушениями биосинтеза, например раковые или зараженные вирусами.

Интерфероны типа I производятся почти любыми клетками (a-интерферон – лейкоцитами, b-интерферон – клетками тканей и фибробластами). Недавно обнаружены еще два интерферона, относящиеся к типу I. Интерфероны типа I не убивают вирусы, а повышают сопротивляемость клеток к инфекциям. При воздействии на клетку интерферона она вырабатывает специальные белки, которые подавляют различные стадии синтеза вирусных белков. Поскольку зараженная вирусом клетка выделяет интерферон в окружающую среду, у соседних клеток также повышается сопротивляемость инфекции.

В настоящее время интерфероны относят к семейству белков-цитокинов, которые выполняют сигнальные функции в клетках.

Свойства интерферонов позволяли надеяться, что их можно будет эффективно использовать в борьбе с вирусами и раком. Однако в естественных условиях клетки вырабатывают интерферон в очень малых количествах. С развитием биотехнологии удалось получить рекомбинантные кишечные палочки E.coli, геном которых содержит гены интерферонов. Теперь интерфероны производятся в промышленных масштабах.

Применение интерферонов в больших дозах вызывает выраженные побочные эффекты: гриппоподобное состояние, выпадение волос, ослабление зрения, аритмии, спазмы венечных сосудов сердца, угнетение функции костного мозга, поэтому применение интерферонов показано в основном при тяжелых заболеваниях. Так, a-интерферон применяют при лечении некоторых видов лейкемий, гепатитов В и С, некоторых кондилом, в больших дозах – для лечения саркомы Капоши, которая часто встречается у больных СПИДом. При некоторых формах рассеянного склероза применяют b-интерферон, а g-интерферон – при хроническом грануломатозе. Несмотря на побочное действие, интерфероны применяют и для лечения таких заболеваний, как грипп, различные герпесные заболевания (стоматит, опоясывающий лишай и т.п.), энцефалиты, полиомиелит, цитомегаловирусная инфекция.

Более целесообразно использование индукторов синтеза интерферонов – веществ, вызывающих усиленный синтез интерферона. Среди них обнаружены вещества, являющиеся также стимуляторами специфического иммунитета. Наиболее эффективные индукторы применяют в клинике: полудан – при тяжелых вирусных заболеваниях глаз, мегосин – при половом герпесе.

Генная терапия

Полезное применение нашла также способность вирусов проникать в клетку и модифицировать ее геном. Оказалось, что вирусы, а точнее их геном, можно применять для лечения или коррекции наследственных заболеваний. Использованию вирусов для этой цели предшествовали достижения молекулярной биологии и генетики в изучении тонкой структуры генов эукариот и их картирование на хромосомах млекопитающих и человека.

Генная терапия занимается лечением наследственных и ненаследственных (инфекционных) заболеваний введением генов в клетки пациентов для исправления генных дефектов или придания клеткам новых функций. Попытки лечения моногенных заболеваний при помощи генной инженерии были проведены в 1989 г.

Главное условие успеха генной терапии – обеспечение эффективного встраивания чужеродного гена в геном клеток-мишеней, создание условий как для длительного функционирования его в клетках, так и для полноценной экспрессии. При этом ген должен экспрессироваться только в определенных клетках и не должен быть канцерогенным.

Различные типы переноса генетической информации у бактерий по Брауну (1968)

Для введения генетического материала в клетку человека могут быть использованы либо процессы, аналогичные трансфекции и трансдукции, либо микроинъекция ДНК, либо вирусные векторы.

Трансдукция – процесс генетической рекомбинации у бактерий, при котором гены одной бактерии передаются другой с помощью бактериофага, в геном которого они включаются. Трансфекция – введение чистой («голой») ДНК в клетку с помощью химических воздействий.

В зависимости от способа введения экзогеных ДНК в геном пациентов генную терапию можно проводить либо в культуре клеток (in vitro), либо непосредственно в организме человека (in vivo). Генная терапия in vivo до настоящего времени не разработана.

Клеточная генная терапия, или терапия ex vivo, – это выделение и культивирование специфических клеток пациента, введение в них чужеродных генов, отбор трансфицированных клеток и введение (реинфузия) их тому же пациенту. В настоящее время в большинстве случаев в генной терапии используют этот подход.

Впервые терапия ex vivo была применена 14 сентября 1990 г. для лечения наследственного иммунодефицита, вызванного мутацией в гене аденозиндезаминазы (ADA). Четырехлетней девочке пересадили ее собственные, предварительно изолированные и трансформированные лимфоциты. С помощью ретровирусного вектора в них были введены гены ADA и neo. Для поддержания лечебного эффекта процедуру повторяли с интервалом в 3–5 месяцев, а всего за 3 года ребенку провели 23 трансфузии трансформированных лимфоцитов без видимых неблагоприятных эффектов.

Успех превзошел ожидания! Девочка смогла вести нормальный образ жизни и не бояться случайных инфекций. Также успешно прошло лечение и второй пациентки с этим заболеванием. Эти результаты позволили в настоящее время проводить клинические испытания генной терапии этого заболевания в Италии, Франции, Великобритании и Японии.

Сходный подход был использован для лечения наследственной семейной гиперхолестеринемии. При этом заболевании, обусловленном мутацией гена рецептора липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), уровень холестерина в крови очень высок, что сопровождается ранними склерозами и инфарктами. В выделенные гепатоциты пациента с помощью ретровирусного вектора ввели нормальный ген рецептора ЛПНП, затем трансформированные клетки ввели обратно пациенту через портальную вену. Лечение также закончилось вполне успешно. Уровень холестерина снизился и более 18 месяцев сохранялся на низком уровне.

Одновременно с развитием исследований в области генокоррекции наследственных дефектов разрабатывали и методы лечения ненаследственных заболеваний (главным образом, злокачественных опухолей и вирусных инфекций). В таблице перечислены основные методические подходы к генотерапии различных опухолей.

Для ряда онкологических, вирусных и иммунных заболеваний пока еще не существует сколько-нибудь эффективного лечения, поэтому генная терапия для таких больных – это единственный шанс на спасение. В настоящее время не разрешается проводить коррекцию дефектов генов на уровне половых клеток и в клетках эмбрионов человека на ранних стадиях развития вследствие реальной опасности засорения генофонда нежелательными искусственными конструкциями или внесения мутаций с непредсказуемыми последствиями для грядущих поколений.

Продолжение следует