Биотехнология чипов

Во всех школьных учебниках по общей биологии описывается такое явление, как кроссинговер. Наши ученые в 1920-е гг. перевели этот введенный американцами научный термин как «перекрест» гомологичных хромосом. При редукционном делении пары хромосом, полученные по одной от отца и от матери, сближаются друг с другом. Поскольку эти пары одинаковые, их назвали гомологичными.

Хромосомы-гомологи несут по одной аллели одного и того же гена, например гена синтеза меланина, определяющего цвет кожи, глаз, волос и т.д. Если одна аллель мутантная, то чаще всего это никак фенотипически не проявляется. В таком случае говорят о гетерозиготности. Потеря функциональной аллели страшна при наследовании признаков, сцепленных с полом. Такое наследование, например, характерно для гемофилии, которой болеют мальчики.

Позднее, когда биология была «поднята» на молекулярный уровень, стали говорить о гомологичной рекомбинации, или «перекомбинировании» участков гомологичных хромосом. Гомологичная рекомбинация возникла задолго до организации генетического материала в хромосомы, т.е. на уровне вирусов и бактерий-прокариот, не имеющих оформленного ядра.

Из кишечной палочки, живущей у нас в толстом кишечнике и ставшей первым объектом биотехнологии, был выделен белок рекомбиназа А (Rec A). Этот белок, как видно из его названия, обладает ферментативной функцией. Он связывается с двухцепочечной молекулой ДНК (разные формы связываются с разными участками) и начинает «кроить и резать» молекулу наследственности.

Этим объясняется появление устойчивости (резистентности) бактерий к антибиотикам: бактерии, обладающие такой устойчивостью, передают другим клеткам фрагменты своей ДНК с геном резистентности. В результате гомологичной рекомбинации ген устойчивости встраивается в геном ранее чувствительного штамма. Таким образом передается, например, ген пенициллазы – фермента, разрушающего молекулу антибиотика пенициллина.

Точно так же ретровирусы встраивают свои геномы в геномы наших клеток, в результате чего люди заражаются вирусными инфекциями, например СПИДом.

С помощью гомологичной рекомбинации в специальных экспериментах «выключают» определенные гены у мышей. Сначала в одну хромосому «встраивают» нефункциональную аллель. Эта операция проводится в эмбриональной стволовой клетке, потомство которой оказывается и в половых железах выросших животных – у самца и самки. Затем спермий и яйцеклетка, которые в силу своей гетерозиготности вполне жизнеспособны, объединяются, и возникает гомозигота по рецессивной (нефункциональной) аллели. В зависимости от природы выключенного гена мышонок может родиться нормальным или с каким-либо дефектом, а может и погибнуть внутриутробно.

Микробный белок Rес А легко образует комплексы с полинуклеотидными последовательностями. В исследовательском институте «Технион» в израильском городе Хайфа исследовали связывание Rес А с коротким отрезком молекулы ДНК длиной 2027 нуклеотидов. Образовавшийся нуклеопротеид назвали «зондом» (пробником). Его гибридизовали (смешали) с длинным (48 502 нуклеотида) центральным отрезком двухцепочечной молекулы ДНК: Rec А соединился со специфичной для него полинуклеотидной последовательностью, и зонд с белком «встроился» в ДНК благодаря гомологичной рекомбинации. При этом образовался частично трехцепочечный комплекс.

После прикрытия центрального участка «маской» зонда концы двухцепочечной ДНК обработали сначала глютаральдегидом (широко используемым в электронной микроскопии), а затем раствором азотнокислого серебра, т.е. провели качественную реакцию «серебряного зеркала» на альдегиды. Получился сэндвич: серебро-о-о-о-о-о-о-о-серебро. Затем с помощью золотохлорного калия и гидрохинона серебро позолотили! Получились самые настоящие «нанопроволочки» длиной в несколько микрон и толщиной всего 50–100 нм, которые выдерживают ток до 20 нА. Это меньше, чем пропускают такие же проволочки из золота, но в 4 раза лучше «посеребренной» ДНК.

Ученые говорят, что с помощью новой технологии, основанной на Rес-ДНК, можно создавать не только линейные, но и пространственные структуры. Дело в том, что с помощью Rеc А одну из цепей можно разорвать и концы «загнуть» кверху, получая Т-образные строительные блоки, которые можно соединять друг с другом не только в плоскости, но и в трехмерном пространстве. Об этом давно мечтают производители многослойных чипов. В принципе, можно ограничиться всего лишь одним нуклеотидом, размер которого не превышает 0,3 нм.

Но ведь «строительные леса» из рекомбинированных молекул ДНК могут нагружаться и другими белками, в частности гемоглобином, хлороглобином, бактериородопсином, а также GFP – зеленым флуоресцирующим белком. Ген GFP выделен из медузы и сейчас активно используется для «мечения» разных организмов и клеток.

Не так давно ген GFP ввели макаке-резус, благодаря чему ее клетки стали светиться под люминесцентным микроскопом, что очень удобно при проведении самых разных исследований, в том числе и связанных со стволовыми клетками. Журнал Nature в номере от 4 апреля 2002 г. опубликовал статью, в которой была прослежена судьба эмбриональных стволовых клеток. Оказалось, что они изредка дают тетраплоидные гибриды с нервными клетками, что легко было проследить благодаря тому, что последние светились зеленым светом. Таких примеров уже много, но мы несколько отвлеклись.

Rес А можно «гибридизовать» с GFР, который уже используется для создания ячеек светооптической памяти, как и бактериородопсин, который меняет свою конформацию и цветность при освещении лазером. Есть и другие перспективы. Так, например, на основе гемоглобина можно создать сверхминиатюрный датчик CO₂ или О₂.

Это какого же прогресса и миниатюризации достигнет молекулярная электроника! Ведь проводники с сечением менее 100 нм практически не будут выделять тепло, что позволит располагать их в микросхемах очень плотно. А если еще учесть, что в ядре клетки сечением всего в 1 мкм как-то упакованы 3 млрд нуклеотидов, да еще с целым набором белков, ядрышком и т.д., и представить себе, что вместо серебра и золота будут использованы высокотемпературные сверхпроводящие материалы…

По материалам:

Science, 2002, № 5578, с. 72.