С.Ю. АФОНЬКИН

Починка ДНК

Проблема опечаток

В популярной литературе ДНК часто сравнивают с длинным текстом, в котором содержится генетическая информация, т.е. информация о строении и работе организма. Эта образная аналогия безусловно верна, надо только помнить, что в отличие от привычных текстов откровения ДНК написаны не тридцатью тремя, а всего лишь четырьмя «буквами». Их роль играют нуклеотиды – аденин, тимин, гуанин и цитозин, которые в генетическом тексте идут друг за другом, образуя единую длинную «строчку».

Молекула ДНК состоит из двух закрученных друг относительно друга и соединенных друг с другом нуклеотидных цепочек. Цепочки расположены так, что каждый нуклеотид одной цепочки связан со строго определенным, комплементарным ему, нуклеотидом другой цепочки: аденин соединяется с тимином двумя водородными связями, а гуанин с цитозином – тремя. Почему ДНК имеет именно такое строение, будет ясно из последующего рассказа.

Каждая тройка нуклеотидов образует код, или «слово», например, «название» одной из аминокислот. Роль знаков препинания, пробелов, указаний, с какого места начинается та или иная «фраза», играют также определенные последовательности кодов.

Правильное положение каждого знака-нуклеотида в ДНК и его точная связь с комплементарным нуклеотидом на противоположной цепочке чрезвычайно важны для правильной работы клетки. Даже единичная «опечатка» в тексте ДНК может привести к катастрофическим последствиям. Замена даже одного нуклеотида в ДНК может привести к тому, что клетка начнет производить белок, в котором одна из аминокислот будет заменена другой. Если же эта аминокислота играет ключевую роль, например, входит в активный центр фермента, работа белка будет существенно нарушена.

Обычно в издательской практике, прежде чем напечатать книгу или газету, их просматривают редактор и корректор. Они стараются ликвидировать все досадные неточности, опечатки и ляпсусы, которые были допущены автором или наборщиком. Существует ли аналогия подобной правки в клетке?

Да, существует. Более того, без постоянно работающей системы коррекции ДНК наверняка было бы невозможно появление сложно устроенных клеток и организмов.

Вредоносный свет

Удивительно, что, несмотря на свою важную, ключевую роль в работе клеток, нить ДНК является очень нежным образованием и повредить ее ничего не стоит.

О вредоносном действии радиационного излучения наслышаны все. Вообще фоновый уровень радиации необходим для существования всех организмов. Однако облучение, превышающее в несколько раз фоновый уровень, является достаточно жестоким ударом для любого организма.

Однако и обычный солнечный свет представляет для ДНК серьезную угрозу. Водный раствор ДНК прозрачен, как стекло и точно так же, как стекло, он пропускает видимую часть солнечного света и поглощает ультрафиолетовые (УФ) лучи. Эти лучи едва достигают поверхности Земли, поскольку основной их поток задерживается в верхних слоях атмосферы озоновым экраном. Однако иногда ультрафиолетового облучения оказывается достаточно, чтобы повредить ДНК.

Чаще всего это происходит следующим образом. Квант света – фотон – может беспрепятственно пролететь сквозь клеточные мембраны и другие структуры, и столкнувшись с ДНК, передать ей свою энергию. Когда эта энергия поглощается нуклеотидом, он переходит в возбужденное состояние.

Дальше все зависит от того, с каким именно нуклеотидом это произошло. Если это аденин или гуанин, то энергия возбуждения быстро переходит в тепловую и структура ДНК не меняется. Если же порцию дополнительной энергии получили тимин и цитозин, то последствия могут быть весьма существенными. К примеру, в этой ситуации между двумя расположенными рядом на одной цепи тиминами может появиться сшивка – дополнительная химическая связь. При этом возникает фотодимер тимина (тиминовый димер) – молекула, в которой четыре расположенных по углам квадрата атома углерода соединены ковалентными связями (рис. 1). Если сравнить ДНК с застежкой-молнией, то тиминовый димер похож на два соседних зубца одной ее половинки, которые сошлись вместе и не позволяют теперь молнии застегиваться. ДНК с таким нарушением уже не может нормально работать. С нее теперь невозможно считать информацию, необходимую для производства белков, или снять копию, следовательно, процессы жизнедеятельности клетки нарушаются, а деление ее останавливается. Ферменты, ответственные за копирование ДНК и считывание с нее информации, дойдя до тиминового димера, либо «перепрыгнут» через него, что приведет к разрыву синтезируемого белка на две части, либо вовсе остановятся. Вот к каким неприятным последствиям может привести действие одного-единственного фотона!

Рис. 1. Образование тиминового димера

Помимо образования димеров в ДНК возможны и другие нарушения. Например, потеря основания, замена одного основания на другое, неправильное их спаривание, разрыв одной цепи ДНК... Такие единичные повреждения биологи называют точечными мутациями.

Ремонтный набор

Ясно, что если бы у клеток не было защиты от таких нарушений ДНК, то вскоре многие гены были бы необратимо повреждены, что неизбежно привело бы организм к полной катастрофе. Неудивительно поэтому, что все клетки регулярно и постоянно занимаются репарацией – своеобразной «санацией» своей ДНК.

Первые доказательства того, что такие процессы имеют место, были получены еще в начале 60-х гг. XX в. в опытах на бактериях. После облучения ультрафиолетом кишечные палочки начинали интенсивно «чинить» свою ДНК – то есть удалять поврежденные облучением участки и восстанавливать исходную последовательность нуклеотидов. Со временем удалось разобраться во всех тонкостях этого процесса. Оказалось, что в распоряжении клеток находится целый набор уникальных белков, работающих словно миниатюрные насадки бормашины, необходимые для постановки зубных пломб. Только работают они не с эмалью и дентином зуба, а с молекулой ДНК.

Репарация начинается с того, что специальный белок, УФ-эндонуклеаза, находит тиминовый димер и рядом с ним делает разрыв цепи ДНК (рис. 2, c. 6). Вторая цепь остается при этом целой. Затем за работу берется другой белок – экзонуклеаза. Она, отщепляя по одному, удаляет по обе стороны от разрыва несколько сотен нуклеотидов – на всякий случай (точно так же и стоматолог высверливает в поврежденном зубе лунку пошире, чтобы уже с гарантией удалить все поврежденные кариесом участки). В результате на цепи ДНК (там, где был обнаружен тиминовый димер) возникает брешь длиной в несколько тысяч нуклеотидов. Эту брешь теперь быстро заделывает третий белок – ДНК-полимераза (рис. 3, c. 6). Она «проезжает» по второй, нетронутой цепочке ДНК и встраивает в первую цепочку комплементарные нуклеотиды. Завершает эту блестящую работу последний белок – лигаза (рис. 4). Она «зашивает» разрывы на починенной цепочке ДНК, да так искусно, что не остается никаких швов. В результате существовавшая до повреждения структура ДНК полностью восстанавливается.

Рис. 2. Этапы репарации ДНК

Рис. 3. Реакция, катализируемая ДНК-полимеразой

Рис. 4. ДНК-лигаза восстанавливает разорванную фосфодиэфирную связь

Теперь становится ясным смысл двухцепочечности ДНК. Биологи, занимающиеся проблемой возникновения жизни, считают, что первыми соединениями, возникшими на заре биологической эволюции и способными строить свои копии, т.е. самостоятельно реплицироваться, были одноцепочечные рибонуклеиновые кислоты – РНК. А связанные с ними (закодированные в РНК) белки способствовали процессу их воспроизводства.

Понятно, что в случае любых нарушений структура таких одноцепочечных первичных РНК повреждалась необратимо – для их восстановления не было копии. Появление двухцепочечных молекул ДНК позволило эффективно восстанавливать поврежденные участки, достраивая их по неповрежденным зеркальным копиям. Это была настоящая революция в борьбе с неизбежными «типографскими опечатками» нуклеотидных текстов. Революция, которая наверняка ускорила на много порядков эволюцию клеток примерно 2,5 млрд лет назад!

Ложка дегтя и SOS-репарация

Все было бы прекрасно, если бы любые точечные мутации могли вырезаться и ликвидироваться столь же точно, как это происходит с тиминовыми димерами. К сожалению, порой клетка не в состоянии правильно определить, какую нить ДНК брать в качестве эталона, а какую следует чинить. Именно так обстоит дело в случае неправильного спаривания нуклеотидов. Как определить, какой нуклеотид в данном случае является «неправильным»? На какой цепи произошел сбой?

Репарационная система клетки ответить на такой вопрос не в состоянии. В результате лишь в половине случаев, т.е. когда в качестве оригинала случайно выбирается правильная копия, исходная структура ДНК полностью восстанавливается. Если в качестве образца будет взята копия с ошибкой, то в другую цепь будет встроен комплементарный ошибочному, «неправильный» нуклеотид. Так, вместо пары А–Т может возникнуть пара Г–Ц со всеми неприятными последствиями. Такая точечная мутация «проскочит» через систему контроля репарационных механизмов клетки. Частота точечных мутаций является результатом взаимодействия процессов повреждения и исправления ДНК.

Описанный выше пример работы репарационной системы – лишь один в целом ряду защитных механизмов клетки, оберегающих ДНК от возможных повреждений. Помимо него существуют, например, механизмы репарации, основанные на обмене поврежденных участков ДНК на неповрежденные.

Такую репарацию называют рекомбинационной. Не будем, впрочем, сейчас углубляться во все эти тонкости, тем более что даже у относительно просто устроенной бактерии – кишечной палочки – уже известно не менее пятнадцати генов, кодирующих белки, участвующие в репарации ДНК. Важно другое – повреждение многих из этих генов приводит к повышению частоты мутаций, поскольку система репарации ДНК начинает работать хуже и мутации, возникающие в других участках ДНК, не удается устранить.

Не исключен и противоположный результат, основанный на повышении эффективности работы репарационных систем в результате отбора «положительных» мутаций в генах репарационной системы. Такой отбор может происходить, к примеру, при повышении уровня УФ-облучения или радиационного фона. Возможно, что в такой ситуации клетки будут прибегать к каким-то экстренным мерам защиты своей ДНК.

Подобные механизмы не являются фантазией и неплохо изучены у бактерий. Речь идет о так называемой SOS-репарации. Она может вызваться интенсивным УФ-облучением или подавлением синтеза ДНК в результате нехватки строительного материала, воздействия ядов или появления мутаций в ключевых генах, ответственных за клеточное деление.

В такой ситуации бактерия как бы чувствует, что с ее ДНК произошло что-то действительно серьезное и мелким косметическим ремонтом тут не отделаешься. Серьезные поломки требуют адекватных действий. В результате деление клеток полностью прекращается, а интенсивность репарации резко возрастает. При этом активируется специальный белок RecA. Есть данные, что для его активации нужны фрагменты ДНК, образующиеся в результате серьезных ее повреждений. Белок RecA в прямом смысле режет другой белок, который является репрессором многих генов, – то есть блокирует их работу. Этот белок-репрессор играет роль своеобразной печати, до поры наложенной на дверцы генетических сейфов. Когда белок RecA разрезает белок-репрессор, блок снимается и в клетке активируется сразу множество генов, ответственных за интенсивную репарацию. Иными словами, возникает ситуация своеобразного аврала, в процессе которого клетка пытается спасти свою генетическую информацию.

Трихотиодистрофия и другие нарушения

Трихотиодистрофией называется еще одно генетическое врожденное рецессивное заболевание человека, связанное с нарушением репарации ДНК, хотя эта связь менее очевидна, чем в случае пигментной ксеродермы.

Если поместить волосы больных трихотиодистрофией под микроскоп, становятся видны характерные поперечные полосы, возникающие из-за нехватки в них богатых серой белков. Пучок таких волос становится ломким и напоминает по окраске тигриный хвост. Под таким названием («тигриный хвост») трихотиодистрофия и вошла в историю медицины в 1968 г. К сожалению, это не единственные признаки заболевания. Значительно серьезнее то, что оно связано с нарушением интеллектуальных функций, маленьким ростом и пониженной плодовитостью. У некоторых больных трихотиодистрофией наблюдается также повышенная чувствительность к УФ-облучению, что прямо указывает на повреждение систем репарации ДНК. Вместе с тем у таких больных нет предрасположенности к раку кожи.

Повышенной фоточувствительностью страдают также люди с редким заболеванием, которое было описано в средине 1930-х гг. Коккейном и получило название по фамилии этого исследователя. На генетическую рецессивную природу синдрома указывали его проявления в семьях с родственными браками. Помимо гиперчувствительности к свету больные синдромом Коккейна страдают также глухотой и атрофией зрительного нерва. У них укороченное туловище, большие уши и нос, а также глубоко запавшие глаза. В довершение ко всему они страдают от кариеса и стареют несколько быстрее, чем остальные люди. У них наблюдается ряд мозговых нарушений. Редко кто из людей с таким диагнозом доживает до 18–20 лет.

Клетки соединительной ткани людей с синдромом Коккейна очень плохо выживают после таких доз УФ-облучения, которые для клеток здоровых людей являются относительно безвредными. Этот факт указывает на то, что все описанные выше неприятные проявления болезни могут быть косвенными следствиями нарушения репарации ДНК.

Специалисты могут назвать еще несколько врожденных заболеваний человека, которые, скорее всего, вызваны нарушениями репарации ДНК. Среди них атаксия-телеангиэктазия, при которой рождаются люди с так называемой атаксией – прогрессивным церебральным параличом и патологическим расширением кровеносных сосудов на коже и конъюнктиве глаз. Они страдают умственной и иммунной недостаточностью. Приблизительно у 10% больных в раннем возрасте развиваются злокачественные опухоли. По оценкам специалистов каждый сотый, а по некоторым данным даже каждый двадцатый человек является носителем гена этого заболевания, которое, по счастью, не проявляется, если в гомологичной хромосоме работает соответствующий неповрежденный ген.

У больных синдромом Блума, еще одним наследственным заболеванием, связанным с нарушением репарации ДНК, обнаружена недостаточность ДНК-лигазы. Вследствие этого у них повышена вероятность возникновения онкогенных заболеваний.

Ясно, что подобные генетические нарушения систем контроля за состоянием ДНК должны выбраковываться естественным отбором и поэтому не закрепляются в человеческой популяции. Те немногие случаи, которые все-таки удается обнаружить, позволяют ученым изучать тонкие механизмы репарации ДНК в клетках человека и те страшные последствия, к которым приводят нарушения в их работе.

Ксеродерма

Для любых клеток проблема защиты своей ДНК от всевозможных повреждений является настолько фундаментальной, что ответственные за подобную протекцию гены оказались очень схожими и у человека, и у грызунов, и у пивных дрожжей. Не вызывает сомнения, что эти гены являются неотъемлемой частью генома практически любого организма.

Нарушения в работе этих важных генов приводят к тяжелейшим последствиям. У человека наиболее известные генетические заболевания – пигментная ксеродерма, синдром Коккейна и трихотиодистрофия.

Ксеродерма распространена во всем мире. По счастью, частота ее встречаемости невелика и составляет, например, в США 1 случай на 250 тыс., а в Японии – на 40 тыс. Больные ксеродермой (от греч. «ксеро» – сухой и «дерма» – кожа) крайне чувствительны к солнечному свету. На поверхности их кожи часто возникают множественные веснушки и даже рубцы, кожа меняет свою пигментацию и становится сухой. При этом заболевании страдают прежде всего ткани и органы, на которые непосредственно воздействует солнечный свет, в частности, роговица, сетчатка и хрусталик глаза. Самое печальное то, что у больных часто уже в юном возрасте возникают различные виды рака кожи – меланомы и карциномы. Средний возраст больных ксеродермой, у которых появляются раковые опухоли, составляет всего 8 лет, тогда как в среднем подобные новообразования появляются только к 50 годам. Даже в полости рта, куда свет попадает все же нечасто, у больных ксеродермой опухоли возникают в 20 тыс. раз чаще.

Ксеродерма – наследственное рецессивное не связанное с полом заболеванием. Это означает, что она с равной вероятностью встречается как у женщин, так и у мужчин и проявляется только в том случае, если нарушения в соответствующих генах присутствуют сразу в двух хромосомах – одной материнской и парной ей отцовской.

Что именно повреждается в системе репарации ДНК при ксеродерме, еще не до конца ясно. Известно лишь, что клетки таких больных сверхчувствительны к воздействию УФ-лучей, химических мутагенов и канцерогенных веществ, образующих с ДНК прочные соединения. Вместе с тем эти клетки обычно сохраняют нормальную чувствительность к ионизирующей радиации.

Как это нередко бывает в случае генетически обусловленных заболеваний, ксеродерма является следствием повреждения не одного участка ДНК, а нескольких. К настоящему времени выделяют по меньшей мере семь типов повреждений и, как следствие, семь различных форм этого заболевания.