Л.Г. БЯЗРОВ

Трансплантация лишайников как метод лихеноиндикации

Трансплантацией называют перенос организма с его местообитания в место, где он необходим для какой-либо цели, например, для мониторинга загрязнения окружающей среды. Лихеноиндикация предполагает использование лишайников в качестве биоиндикаторов состояния окружающей среды, в частности загрязнения воздуха. Наблюдение за состоянием трансплантированных лишайников с целью лихеноиндикации называют активным мониторингом, а наблюдение за состоянием представителей естественно произрастающих в данной местности лишайников – пассивным мониторингом.

Основными достоинствами использования трансплантатов для мониторинга качества воздуха считают:

– возможность размещения слоевищ лишайников во всех местах, где желателен мониторинг качества воздуха, в том числе и там, где лишайники по тем или иным причинам отсутствуют;
– возможность использования в каждой местности достаточного количества образцов массовых видов лишайников, чтобы обеспечить требуемую точность исследования и полноту охвата территории;
– возможность размещения в тестируемых точках сравнительно однородного материала, собранного в местах с известными условиями существования, что облегчает интерпретацию результатов;
– возможность выбора конкретных представителей тех или иных видов лишайников из определенных местообитаний;
– возможность определения темпов роста загрязнений, вызывающих повреждения лишайников.

Недостатками пересадки являются, с одной стороны, частые случаи уничтожения трансплантатов местным населением, с другой – перемещение организмов из привычной для них среды обитания в новые условия, приводящее к тому, что реакция трансплантатов на загрязнения может не всегда совпдать с реакцией постоянно растущих здесь особей того же вида.

Первые опыты по пересадке лишайников были проведены в конце XIX в. в Мюнхене – представителей нескольких напочвенных видов из нетронутых человеком ландшафтов пересадили в город, где все они вскоре погибли. В августе 1959 г. в Ботанический сад Тартуского университета (Эстония) из Хибинского горного массива (Мурманская обл.) пересадили представителей пяти видов напочвенных лишайников. Уже через месяц после пересадки были зафиксированы признаки значительных повреждений слоевищ, а к середине июля 1960 г. все они погибли. Сходными были результаты трансплантации в марте 1987 г. десяти слоевищ Hypogymnia physodes из Западной Германии в Коста-Рику, где среднегодовая температура превышает 20 °С, а уровень осадков – 1900 мм/г. Все перемещенные в Южную Америку талломы погибли через 3,5–10 месяцев.

Для изучения экологии и физиологии лишайников трансплантаты начали применять в 1950–1960-е гг. Первые методически корректные лихеноиндикационные исследования с использованием трансплантатов были проведены в США и Германии.

В США были пересажены слоевища эпифитных лишайников Flavoparmelia caperata и Lecanora leptyrodes с частью их субстрата. Диски коры диаметром около 3,5 см и толщиной около 1,5 см отбирали с деревьев в чистой местности с помощью пробоотборника и пересаживали в отверстия того же диаметра, подготовленные на деревьях той же породы на разном удалении от Бруклина (район Нью-Йорка). Затем определяли состояние пересаженных слоевищ лишайников: изменение цвета, ослабление прочности прикрепления к субстрату, изменение структуры органов размножения, плазмолиз водорослевых клеток в зависимости от периода экспонирования и удаления от источника загрязнения. Для определения воздействия высоты поселения на состояние лишайников на деревьях у Брукхевенской лаборатории вблизи Нью-Йорка диски с Cladonia chlorophaea были перемещены с оснований на более высокие части стволов деревьев-хозяев (форофита).

В Германии этот метод незначительно модифицировали, прикрепив диски с лишайниками к деревянным щитам, что позволило трансплантировать лишайники в места, где деревьев было мало.

Отбор слоевищ лишайников для пересадки и подготовка их к экспонированию

Для трансплантации чаще всего используют эпифитные (т.е. растущие на деревьях) лишайники. Их слоевища вместе с субстратом специальными бурами в виде дисков отделяют от деревьев. Затем эти диски тем или иным способом размещают на обследуемой территории. Если предполагается оценка загрязнения тяжелыми металлами, то при отборе образцов для пересаживания и их подготовке к трансплантации не рекомендуют пользоваться металлическими предметами.

Для трансплантации выбирают виды, талломы которых легко собрать и за которыми просто наблюдать. В Европе обычно используют слоевища Hypogymnia physodes, Evernia prunastri, Parmelia sulcata.

Трансплантация лишайников использовалась не только для индикации загрязнений. Так, виды Lobaria, чувствительные к загрязнению воздуха, пересаживали с целью восстановления их популяций на территориях, где они исчезли. Пересаживали лишайники и для установления влияния различных факторов на показатели их жизнедеятельности при адаптации к непривычным условиям.

В качестве критерия действия загрязнителя предлагается использовать долю поврежденной части экспонированного слоевища от его общей поверхности за период наблюдения. Отмершие части лишайника лишены зеленых и сине-зеленых пигментов; соответственно, они отличаются характерной белой и серой окраской. Измерения проводят по фотоснимкам слоевищ, сделанным до и после периода экспонирования.

Лишайники для экспонирования отбирают вместе с их субстратом стандартным ручным буром (диаметр 40 мм) с упавших старых деревьев одной породы (такие деревья, как правило, ищут зимой). Вырезанные шайбы должны быть по меньшей мере на 2/3 покрыты хорошо развитыми экземплярами лишайника (по возможности одно слоевище на куске коры). Только в исключительных случаях могут отбираться лишайники с растущих деревьев; возникающие при этом раны должны быть залечены.

Лишайники из различных местообитаний могут неодинаково реагировать на новые для них условия среды. Поэтому в каждой серии измерений экспонируемые лишайники должны быть из одного строго ограниченного района с возможно более сходными микроклиматическими условиями (например, должны расти на определенном отрезке ствола дерева). Остающиеся различия выравнивают акклиматизацией слоевищ перед экспонированием в течение определенного времени (до 4–5 мес.) в условиях местного микроклимата.

Такая процедура обязательна, если место отбора образцов и область экспонирования климатически сильно различаются. Проводится она в стандартных условиях. Для этого слоевища лишайника с субстратом приклеивают древесной замазкой на стеллажи из необработанной древесины, где все экземпляры имеют равные условия освещения и вентилирования (рис. 1). Воздух места акклиматизации должен быть чистым, а его климатические показатели должны быть сходны с таковыми места будущего экспонирования.

Для экспонирования выбирают неповрежденные экземпляры лишайников, по возможности одинакового размера и состояния развития. Перед экспонированием проводят строгий контроль качества слоевищ. Для этого все имеющиеся в наличии лишайники располагают рядом и увлажняют, затем внимательно просматривают и отбраковывают талломы с дефектами, т.е. такие, цвет которых в насыщенном водой состоянии не зеленый. При одинаковом качестве предпочтение отдается более крупным экземплярам.

Чаще всего для экспонирования лишайников используют специальные деревянные щиты различного размера. В Германии, например, рекомендуют щиты 290х170х25 мм, в которых высверлены 10 цилиндрических лунок глубиной 15–20 мм и диаметром 42 мм (рис. 2). Кусочки коры с лишайниками закрепляют в лунках так, чтобы кора субстрата находилась на одном уровне с древесиной щита, затем отверстия замазывают древесной замазкой или воском. Каждое трансплантированное слоевище получает индивидуальный номер. Такие щиты прикрепляют к вертикальным стойкам высотой 1,5 м и размещают в намеченных точках обследуемой территории. Чтобы защитить экспонируемые лишайники от птиц, в верхнюю часть щита рекомендуют вбивать острые гвозди.

Экспонирование пересаженных слоевищ осуществляют также с помощью специального устройства, называемого «лишайниковой каруселью». Шесть талломов с корой субстрата закрепляют тем же способом, что и на щитах, на шести звездообразно расположенных вокруг центральной оси деревянных носителях, подвешенных к спицам, вставленным в шарообразную ступицу, вращающуюся на вертикальной стойке-трубе (рис. 3). Плоскости отдельных носителей располагаются под одним и тем же углом к стойке. Вращение карусели обеспечивается с помощью ветряного привода, прикрепленного к шарообразной ступице.

Некоторые исследователи экспонировали ветви с растущими на них лишайниками. Есть примеры валунов или обломков горных пород с растущими на них представителями лихенобиоты. Их прикрепляют к деревьям, столбам, щитам, устанавливают в садах и т.д. Предлагали также перевозить куски черепицы с лишайниками из сельской местности или небольших городов в более крупные города.

Оригинальный метод экспонирования слоевищ разных жизненных форм разработан в университете штата Орегон (США). Талломы лишайников без субстрата закрепляют специальным клеем в петлях тонких нейлоновых нитей, которые развешивают в намеченных местах. Такой способ позволяет достаточно точно определять влияние условий экспонирования на рост лишайников, изменение их массы.

Не менее своеобразен способ трансплантации лишайников, использованный в Красноярске. Фрагменты слоевища эпифитного лишайника Xanthoparmelia somlyensis смачивали водой и укладывали на поверхность предварительно увлажненной гранитной крошки, засыпанной в стеклянные банки емкостью 1 л. Банки закрывали полиэтиленовыми крышками с отверстиями и прикрывали бумажным экраном для защиты от прямого солнечного света. Такое устройство обеспечивало поддержание трансплантатов в активном состоянии в течение 3-недельного срока их экспонирования в разных по уровню загрязнения районах Красноярска.

Экспонирование и оценка состояния слоевищ

Приспособления для экспонирования прикрепляют к стойке так, чтобы трансплантаты располагались на высоте 1,5 м над поверхностью почвы. Деревья, здания и другие предметы могут препятствовать движению воздуха, затенять экспонируемые лишайники, поэтому устройства для экспонирования желательно располагать от них на расстоянии не менее 15 м. Если такое требование выполнить трудно, можно их размещать в открытых дворах, садах, на полянах или прогалинах. Располагать их на крышах, рядом с деревьями, вблизи строек, на улицах или открытых площадях с сильным загрязнением почвы все же нельзя. Экспозиционные щиты весь период наблюдений по всей изучаемой территории должны быть одинаково ориентированы относительно частей света (обычно на север).

Для контроля рекомендуют помещать устройства с трансплантатами и в точках отбора образцов лишайников.

Продолжительность экспонирования и частота наблюдений определяются решаемыми задачами и выбором фиксируемых признаков. Трансплантированные слоевища желательно измерять и фотографировать ежемесячно, но этот интервал может быть увеличен или сокращен в зависимости от характера получаемых данных.

Если фиксируются внешние проявления повреждений слоевищ, то лишайники фотографируют непосредственно перед экспонированием и через установленные сроки. Фотографирование производят со штатива, для равномерного освещения используют вспышку. Чтобы данные можно было сравнивать, в течение всего периода наблюдений необходимо пользоваться одним и тем же оборудованием и фотопленкой. Перед каждой съемкой лишайники равномерно опрыскивают дистиллированной водой и ждут (около 5 мин), пока капли воды не исчезнут со слоевища.

Помимо внешних признаков нередко фиксируют динамику изменения и других показателей (отмирание водорослевых клеток, накопление элементов, физиологические параметры и др.), что требует изъятия слоевищ в намеченные сроки. При таком подходе используется большое число слоевищ, чтобы в каждый срок можно было изымать достаточное для статистической обработки данных число проб. Надо помнить также, что часть трансплантатов всегда погибает от естественных и непредусмотренных причин.

Изменения слоевищ определяют путем сравнения их характеристик, оцененных перед началом экспонирования и зафиксированных в сроки наблюдений. При этом вносят поправку на возможные изменения характеристик слоевищ, экспонированных в местах их сбора.

Простейшими способами оценки действия новых условий на пересаженные слоевища является определение смертности пересаженных слоевищ, а также морфологических изменений талломов: цвета, толщины слоевища, внешнего вида плодовых тел, толщины лопастей и т.д. Для определения цвета можно пользоваться специальными таблицами. Изменение внешних признаков пересаженных слоевищ оценивают визуально в баллах или измеряют палеткой долю поврежденных частей талломов. Так, в упомянутом выше исследовании в Нью-Йорке использовали 4-балльную шкалу оценок (3, 2, 1, 0), где баллом «3» оценивалось здоровое слоевище, а баллом «0» – полностью погибшее слоевище. Используются и другие шкалы, выбираемые из соображений удобства описания результатов наблюдений.

В Бремене (Германия) цветные фотоизображения пересаженных слоевищ Parmelia sulcata анализировали с помощью компьютерной программы. Изменение окраски коррелировало с параметрами «нарушения среды местности», которые соответствовали интенсивности движения городского транспорта и степени загрязнения воздуха.

Воздействие загрязнителей можно оценивать и по влиянию их на рост слоевищ. На юго-западе Финляндии изучали рост трансплантированных эпигейных лишайников Cladina вблизи бумагоделательной фабрики. Прирост слоевищ на расстоянии 0,5 км от предприятия был на 50% меньше, чем на расстоянии 5 км.

В Венеции (Италия) слоевища Flavoparmelia caperata помещали на промышленную, сельскую и урбанизированную территории и наблюдали за изменением поверхности трансплантированных талломов по сравнению с контролем. За время экспонирования (с сентября 1994 по июнь 1995 г.) в контрольной точке происходило медленное увеличение поверхности слоевищ. В промышленной зоне поверхность слоевищ значительно уменьшилась. В сельской местности в трех точках поверхность слоевищ увеличилась, а в одной точке уменьшилась. На урбанизированной территории значимых изменений площади поверхности слоевищ не обнаружено.

Для измерения других характеристик слоевищ, например, повреждения клеток водорослевого партнера лишайникового симбиоза, используются приборы, позволяющие определять газообмен (O₂, CO₂), содержание хлорофилла, белков, проницаемость мембран, спектральные характеристики слоевищ и т.п. Однако необходимо учитывать, что реакция пересаженных слоевищ лишайников в новых условиях отличается от реакции представителей того же вида, постоянно растущих в местах, куда были перемещены трансплантаты.

Аккумуляция загрязнителей

Помимо визуально обнаруживаемых признаков часто определяют накопление веществ-загрязнителей трансплантированными слоевищами.

В Мурманской области срезанные ветви ели и отрезки стволов березы со слоевищами Hypogymnia physodes разместили в пяти зонах деградации у Мончегорского комбината «Североникель». После 3 месяцев экспонирования в слоевищах измерили концентрации Ni, Cu, Zn, S, Al, P. По мере удаления от источника загрязнения четко убывали концентрации никеля и меди в слоевищах лишайника. На содержание других элементов сказалось влияние других источников загрязнений: Кандалакшского алюминиевого завода, ТЭС и производства фосфора в Апатитах.

В Калифорнии (США) слоевища Ramalina menziesii из «чистой» территории штата пересадили в загрязненные части города Лос-Анджелеса и экспонировали по три месяца летом 1985 г., зимой того же года и летом 1986 г. После каждого периода экспонирования в слоевищах определяли содержание 25 элементов. Оказалось, что концентрации 14 из них (Ba, Ca, Cd, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, P, Pb, Si, Sr, Zn) были, как правило, выше летом, чем зимой. Динамика содержания этих элементов в трансплантатах отражала не только атмосферное загрязнение, но и степень вовлечения их в метаболизм слоевища, а также (в меньшей степени) накопление морских аэрозолей и почвенных частиц.

В Любляне (Словения) яблоневые ветви с Hypogymnia physodes разместили на срок 5 и 11 месяцев в 4 точках города, в том числе у работающей на угле электростанции. После каждого периода экспонирования в талломах определяли концентрации 29 элементов. За исключением Co, Cs, K, Rb, Se и Zn концентрация всех измеренных элементов в слоевищах прямо коррелировала с длительностью экспонирования.

В Израиле трансплантированные слоевища Ramalina lacera экспонировали с декабря 1981 г. по декабрь 1982 г. для определения воздействия тепловой электростанции на окружающую среду. Полученные данные, а также данные одногодичного экспонирования в 1979–1980 г. в тех же точках до начала работы электростанции приведены в таблице.

Таблица. Концентрации некоторых элементов (мг/кг) в экспонировавшихся слоевищах Ramalina lacera до (0) и через 1 год (1) после начала работы электростанции (ТЭС) в Израиле

При анализе данных таблицы следует учитывать, что точки, куда пересаживали слоевища, располагались по разным направлениям от электростанции, поэтому общее уменьшение концентрации элементов с увеличением расстояния имеет исключения. Снижение концентраций Zn и Cu в сравнении с первым периодом экспонирования, вероятно, связано с тем, что эти элементы входят в состав препаратов, широко используемых для борьбы с вредителями ореховых деревьев (пекан), а в 1980–1981 гг. эти препараты почти не применялись.

Можно отметить, что за год работы электростанции произошло значительное увеличение концентраций Ni, Cr и Pb в трансплантатах, особенно вблизи станции. Загрязнение среды первыми двумя элементами связано с выбросами электростанции, а повышенное содержание свинца объяснялось значительным приростом числа автомобилей в данной местности.

Однако число автомобилей не всегда определяет уровень загрязнения. Имеет значение и скоростной режим автомобильных трасс, что показали результаты исследования, проведенного в г. Оулу (Финляндия). Здесь сосновые ветви с бородовидными слоевищами Usnea hirta, собранными в лесу в 15 км от города, разместили в пригороде у скоростной автомобильной трассы с нагрузкой около 25 тыс. автомобилей в сутки, а также на двух улицах города со значительно меньшей нагрузкой (около 14 тыс. автомобилей в сутки) и ограниченной скоростью движения. Продолжительность экспонирования – с 7 августа по 23 сентября 1993 г. Наряду с другими параметрами в слоевищах определили и концентрации 11 элементов. В слоевищах, экспонировавшихся у магистралей с относительно невысокой нагрузкой автотранспорта, концентрации некоторых элементов были выше, чем на трассе. Это может быть связано с более высокой степенью «продуваемости» ветрами высокоскоростной трассы.

В 27 км южнее Будапешта, где преобладают ветры северо-западного направления, на разных расстояниях от шоссе (1–90 м) с интенсивностью движения 10–12 тыс. автомобилей в сутки в течение 3 месяцев экспонировались слоевища Cladonia convoluta. Наивысшая концентрация всех элементов, исключая ванадий, была обнаружена в наиболее близких к дороге образцах лишайника. На расстоянии 1 м от полотна дороги уровни загрязнения Ca, Cu, Ni, Zn были в 2–3 раза выше, Al и Pb – в 3–4 раза выше, а Cr и Fe – в 5 раз выше, чем в контроле. С увеличением расстояния от шоссе концентрации металлов снижались. Повышенные уровни Cd, Pb и Zn отмечались на расстоянии до 30 м на запад от дороги и до 60 м – на восток, Cr – до 2,5 м и до 5 м, Cu, Fe и Al – до 5 м и до 10 м соответственно, Ni – до 5 м с обеих сторон дороги. Не найдена зависимость концентрации V от расстояния от дороги, хотя уровни содержания этого элемента в трансплантатах у шоссе были выше, чем в контроле.