М.Г. ДОМШЛАК
Окончание. См. No 2, 3/2003
Путешествие в невидимый мир
 В клетке, инфицированной
вирусом, вследствие его размножения нарушается
обмен веществ. Это, как правило, приводит к
зависящим от типа вируса изменениям структуры и
функций клетки, состояния самой клетки, ее вида и
условий окружающей среды. Возможны следующие
варианты:
1) потеря способности к размножению,
росту, что приводит к медленной гибели;
2) перерождение нормальной клетки в раковую;
3) слияние нескольких клеток в одну большую
многоядерную клетку – симпласт.
Абу Али Хусейн Ибн Абдаллах Сина
(Авиценна)
Каждая инфицированная одним вирусом
клетка производит около 2 тыс. новых вирусов.
Небольшая группа клеток (11) произведет
примерно 22 тыс. вирионов, способных атаковать
соответственно 22 тыс. здоровых клеток. В свою
очередь эти клетки дадут 44 млн новых убийц. Во
время следующего цикла размножения число
вирусов возрастет уже до 88 млрд, каждый из
которых может убить здоровую клетку.
Впечатляющая цифра!
Мы уже знаем, что вирусы могут вызывать
либо хроническую, либо острую инфекцию. В первом
случае вирус, проникший в клетку, не выдает
своего присутствия. Соответственно и
инфицированная клетка по виду не отличается от
нормальной. Вирус может интегрироваться в ДНК
клетки и при делении передаваться ее потомству.
Следовательно, клетка при делении воспроизводит
вирус. Интегрированный вирус невозможно
обнаружить и выделить из клетки.
В опытах in vitro на культивируемых
клетках человека удалось воспроизвести
хроническую инфекцию вирусом гриппа. Оказалось,
что через несколько поколений в культивируемых
клетках происходило постепенное исчезновение
признаков заражения. В конце концов вирус
исчезал и не проявлял своего присутствия в
течение продолжительного времени. Но затем
внезапно наступала быстрая гибель клеток,
свидетельствующая о неожиданном «возвращении»
вируса. «Беглец» изменился, стал более
агрессивным, приобрел новые губительные для
клеток свойства. Изменились и клетки. Они
приобрели способность к безудержному росту, т.е.
стали злокачественными.
Новые данные породили новые вопросы.
Происходит ли на самом деле интеграция генома
вируса в геном клетки? Почему происходит
повторная активация вируса и его выход из
«подполья»?
Дальнейшие исследования провели на
субклеточных структурах, выделенных из клеток,
инфицированных арбовирусами. Арбовирусами
называют вирусы четырех семейств (тогавирусы,
буньявирусы, реовирусы и рабдовирусы),
передающиеся при укусе кровососущими
насекомыми. Нормальный арбовирус состоит из трех
частей: нуклеиновой кислоты – РНК, внутренней
белковой и внешней белково-липидной оболочек.
Внутреннюю оболочку образуют специфические
белки, а внешнюю – наружная мембрана клетки.
У субклеточных структур – незрелых
вирусов – нет оболочки. Они состоят только из
вирусной РНК и специфических вирусных белков и
представляют собой так называемые
рибонуклеопротеиды (РНП) – комплексы
нуклеиновой кислоты и белка.
Впоследствии было открыто, что РНП
вызывает инфицирование. При выделении
субклеточных структур из инфицированных клеток
были получены еще три типа РНП. При введении в
здоровые клетки все четыре типа РНП вызывали
образование нормальных вирусов.
Как объяснить полученные результаты?
Вирусологи предположили, что кроме истинно
вирусного комплекса РНК–вирусный белок были
получены гибридные РНП – молекулярные химеры, у
которых нуклеиновая кислота прикрыта не только
вирусными белками, но и клеточными. Для
доказательства этого предположения из
нормальных вирусов выделили РНК, добавили ее к
белкам неинфицированных клеток и получили РНП.
При внедрении чужеродного белка
организм человека вырабатывает защитные
антитела, способные найти и нейтрализовать
«пришельца». Гораздо сложнее антителам найти и
обезвредить псевдовирус – гибридный РНП.
Гибридные РНП приобретают выраженную
устойчивость к их действию. Не исключено, что
именно этим объясняется устойчивость
незначительной доли вирусов к действию антител и
в естественных условиях.
Однако не все так безнадежно. В клетках
имеются ферменты нуклеазы, расщепляющие
попавшие в клетку нуклеиновые кислоты. Нуклеазы
не могут расщепить нуклеиновую кислоту,
находящуюся в комплексе с белками. Но при
заражении клеток вирус «раздевается», оставляя
«белковый плащ» снаружи. Кроме того, при вирусной
инфекции активность нуклеаз возрастает, поэтому
теоретически они могут атаковать и расщепить
«голую» вирусную нуклеиновую кислоту.
Тем не менее вирусные инфекции
возможны вследствие способности нуклеиновой
кислоты вируса образовывать гибридные комплексы
с клеточными белками, защищающими ее от нуклеаз.
К этой проблеме мы еще вернемся.
Методы изучения вирусов
Для изучения клеток, инфицированных
вирусом, разработаны различные методы. Один из
широко применяемых методов основан на
использовании флюоресцирующих антител.
При размножении вируса в организме
хозяина вырабатываются антитела, специфически
соединяющиеся с «пришельцем». Эти антитела можно
выделить в чистом виде и получить так называемые
моноклональные антитела, специфические к
какому-либо одному антигену вируса. К антителам
можно присоединить флюоресцентный краситель.
После добавления таких меченых антител к
инфицированной клетке можно с помощью
флюоресцентного микроскопа определить, сколько
вирусных антигенов имеется в клетке и, иногда,
где именно они находятся.
Использование методов иммунологии сыграло
важную роль в классификации вирусов и изучении
противовирусного иммунитета.
Определение скорости и характера
размножения вирусов основано на регистрации
клеточных патологий, вызванных вирусом.
Диагностика некоторых вирусных
инфекций основана на обнаружении телец
включений, в клетках, инфицированных вирусами
бешенства, оспы, ящура и др.
Метод ультрацентрифугирования в
градиенте плотности позволяет получать вирусы и
их составляющие в чистом виде.
Метод электрофореза в
полиакриламидном геле позволяет разделять смеси
макромолекул, например белков. Вначале он был
применен при изучении вируса полиомиелита, а
затем и других вирусов.
Вирусы способны кристаллизоваться, а
структуру кристалла можно детально изучить с
помощью рентгеноструктурного анализа. Это
позволило установить связь между свойствами
отдельных белков и структурой вириона.
С использованием электронной
микроскопии можно определять размеры вирусов,
изучать их ультратонкую структуру,
идентифицировать «капризные» вирусы, например
возбудителя гастроэнтерита.
Схема репликации двухнитчатой
ДНК-вируса
Биосинтез ДНК фага–ФХ174 в бесклеточной
системе:
1 – циклическая одноцепочечная «+» нить ДНК-фага;
2 – вновь синтезированная незамкнутая «–» нить
ДНК; 3 – духцепочечная инфекционная ДНК; 4 –
дезинтеграция ДНК после обработки ДНК-азой и
тепловой денатурации; 5 – разделение структур
ДНК центрифугированием с целью выделения вновь
синтезированной инфекционной ДНК; 6 и 7 –
биосинтез ДНК из искусственно синтезированной
ДНК
Схема репликации РНК-вируса
Схема репликации однонитчатой
ДНК-вируса
Технический арсенал вирусологии
В каждом положении отыщется
что-нибудь утешительное,
если хорошо поискать.
Даниэль Дефо
Изучение вирусов невозможно без
получения их в достаточном для исследований
количестве. Обычно для размножения вирусов
используют либо клетки многоклеточных
организмов, либо бактерии.
Некоторые вирусы, например вирус
парагриппа из семейства парамиксовирусов (к нему
же относятся вирусы кори и паротита), хорошо
размножаются в куриных эмбрионах. Плотность
вирусов парагриппа в эмбрионе достигает 1 млрд
частиц в 1 см3.
В конце 1940-х гг. сама жизнь
потребовала срочного решения задачи получения
вирусов в больших количествах. Необходимо было
создать вакцины для борьбы с полиомиелитом и
гриппом.
В 1949 г. американский ученый
Дж.Эндерс (1897–1985, Нобелевская премия 1954 г.),
работая над созданием вакцины против
полиомиелита, предложил метод культивирования
вирусов в срезах ткани, а не в целых организмах.
Именно этот метод позволил затем в короткий срок
провести массовую вакцинацию населения против
вируса полиомиелита.
Позже для этой цели стали применять
культуры клеток. Для приготовления культуры
живую ткань расщепляют ферментами на отдельные
клетки. Клетки перемешивают с подходящей
питательной средой и переносят в стерильные
плоские герметичные сосуды – «матрасы». Клетки
постепенно оседают на дно и распластываются по
стеклу или пластику. Затем они начинают делиться,
достаточно быстро образуя слой толщиной в одну
клетку. Теперь можно проводить эксперименты на
клеточном уровне, непосредственно наблюдая
разрушительное действие вирусов. Под обычным
микроскопом легко отличить инфицированные и
погибшие клетки от нормальных. Собственно
говоря, количество вирусов определяют по этим
показателям.
Р.Далбекко (р. 1914, Нобелевская
премия 1975 г.) усовершенствовал этот метод:
покрыл клетки тонким слоем агара. Теперь очаги
выглядели как пятна, более прозрачные, чем
неповрежденные клетки (метод негативных пятен).
Вирусологи получили простой и надежный метод
накопления и количественного определения
вирусов. Этот метод был использован
А.Б. Сэбином (1906–1993) при получении его
знаменитой живой вакцины против полиомиелита.
Однако использование животных в
качестве инкубаторов для вирусов не утратило
своего значения. При введении в брюшную полость
мыши клеток асцитной карциномы (злокачественные
раковые клетки) происходит их безудержное
размножение. Спустя несколько дней эти клетки в
виде взвеси заполняют всю полость. Впоследствии
установили способность и других клеток расти во
взвеси in vitro, вне организма.
Метод культивирования клеток был
найден. Оставалось смоделировать «мышку», дающую
взвесь клеток в промышленных масштабах.
Совместный труд биологов и конструктов привел к
созданию реакторов для культивирования клеток
во взвешенном состоянии. Теперь вирусы можно
было не только изучать, но и выделять в
количестве, достаточном для производства вакцин
– оружия против вирусов.
Работа в микробиологической
лаборатории:
1– отбор микробной суспензии из пробирки; 2 –
посев на чашку Петри;
3 – просмотр под микроскопом выросшей на агаре
колонии
Злодеяния вирусов
Поминутно мертвых носят,
И стенания живых
Боязливо бога просят
Успокоить души их!
Поминутно мести надо,
И могилам меж собой,
Как испуганное стадо,
Жмутся тесной чередой.
А.С. Пушкин. Пир во время
чумы.
Такие вирусные болезни, как оспа,
грипп, полиомиелит, желтая лихорадка, подпадают
под действие Международных санитарных правил
или подлежат Международному надзору.
ОСПА
Натуральная оспа – очень заразное
заболевание. Заразны почти все выделения
больного: мокрота, капельки слизи из зева и
полости рта, разбрызгиваемые при кашле, чихании,
крике. Заразны моча, кал. Вирус оспы долго
сохраняется в постельном белье, домашних вещах,
особенно в сухом состоянии. Заражение происходит
либо непосредственно от больного, либо через
зараженные предметы и вещи.
В 1886 г. Бьюст обнаружил возбудителя
оспы. В 1906 г. Пашен предложил окрашивать
вирионы специальной краской, позволяющей
наблюдать их в световом микроскопе. Вирусы оспы
довольно крупные и первыми были рассмотрены под
микроскопом. Окрашенные вирионы получили
название «тельца Пашена». Вирус оспы содержит
двухцепочную линейную ДНК, размножается в
цитоплазме клеток, образуя характерные
включения.
Возбудитель оспы проникает в организм
человека через верхние дыхательные пути
(слизистую носоглотки) воздушно-капельным путем,
а также через кожу. Затем возбудитель попадает в
кровь, с током которой разносится по всему
организму. Вирус интенсивно размножается в
клетках костного мозга и печени, откуда опять
попадает в кровь, затем – в большом количестве в
клетки слизистой и кожи. Здесь вирус интенсивно
размножается и вызывает типичное поражение,
последовательно проходя стадии папулы, везикулы,
пустулы, корочки и рубца. Покрытое «оспинами»
лицо – типичное последствие перенесенной оспы.
Оспенный больной заразен примерно с третьего дня
после заражения (инкубационный период – до 12
дней) и до отпадения оспенных корочек.
Оспа известна с древнейших времен.
Рукописные памятники Древнего Египта позволяют
предполагать, что она возникла на территории
Центральной Африки. Так, в египетском папирусе,
составленном Аменофисом I за 4 тыс. лет
до н.э., описана оспа. На коже мумии,
захороненной в Египте за 3 тыс. лет до н.э.,
сохранились оспенные поражения. В древнейшем
китайском трактате «Чеу-Чиуфа» упоминается оспа,
которую китайцы называли «ядом из материнской
груди» (1120 г. до н.э.). Первое классическое
описание оспы сделал арабский врач Аль-Рази
(IX–X в. н.э.). Ибн-Сина (980–1037) – первый
врач, описавший оспу как заразную болезнь.
В прошлом оспа была самым опасным и
распространенным заболеванием. Столетиями она
свирепствовала в Азии, откуда в VI в. н.э. сарацины
завезли ее в Европу.
В XVI - XVIII вв. произошел наиболее
убийственный «расцвет» оспы, тогда от этой
болезни умирал каждый третий ребенок. В Европе в
отдельные годы оспой заболевало до 12 млн человек,
1,5 млн человек умирало.
Оспа была широко распространена в
войсках и, передвигаясь с ними, страшнее войн
опустошала целые области.
Древний историк Курциус (I в. до н.э.)
писал, что оспа уничтожила воинов Александра
Македонского, возвращающихся из завоеванной
Индии.
Во время эпидемий оспа поражала
молодых и старых, простолюдина и владыку, не щадя
никого, проникала в хижину бедняка и во дворцы
царей. От оспы умерли русский император Петр II,
австрийский император Иосиф, короли Франции –
Людовик XIV, Людовик XV, король Нидерландов
Вильгельм II Оранский, королева Англии Анна.
Древний историк Тебезиус написал:
«Никакой народ, никакая раса, никакое звание,
никакой темперамент, ни возраст, ни пол не
щадились оспой. Все трепетали перед ней».
Оспа приобретала чудовищную силу на
территориях, куда она проникала впервые. В XVI в.
конкистадоры завезли оспу в Америку. Возможно,
это было первое бактериологическое оружие,
использованное против людей: индейцам
преднамеренно оставляли одеяла от больных оспой,
развешивали на деревьях рубахи, пропитанные
оспенным гноем.
В 1520 г., во время завоевания Мексики от
оспы погибли 3,5 млн человек. Вымирали целые
племена. Из оставленных очевидцами описаний
следует, что «несметное количество трупов
туземцев валялось в лесах». Страна опустела. В 1576
г. в Перу погибло свыше 2 млн человек.
В Средние века при возникновении оспы
основной рецепт гласил: «Быстро, далеко, долго»,
т.е. предписывалось убираться быстро, далеко и
долго не возвращаться.
В Европе даже в XVIII в. от оспы ежегодно
погибало 0,5 млн человек. Многие из «благополучно»
перенесших оспу слепли, лица их
обезображивались.
В 1563 г. оспа была занесена в Бразилию.
Во время эпидемии только в провинции Чату
погибли 100 тыс. человек.
Методы заражения куриных эмбрионов: а –
заражение в полость аллантоиса; б – заражение в
амнион закрытым способом; в – заражение в амнион
открытым способом; г – заражение на
хорионаллантоисную оболочку
Продолжение следует
|