Истоки генной инженерии растений

Есть в словах «научное открытие» некая магия. Возможно, некоторые из нас к концу XX века и разучились удивляться новостям науки, но у большинства при известии об очередном открытии чувства обостряются, как, возможно, было еще у древних людей при встрече с чем-то неизвестным. Любопытство и настороженность одновременно. Как нам жить с этим «новорожденным» знанием? Может быть, оно изменит нашу жизнь? В лучшую ли сторону? А вдруг оно опасно? В чем его смысл, как автору удалось сделать открытие? В последние десятилетия революционные открытия в биологии вызывают бурные споры и держат в напряжении буквально все человечество.

Всем известны страсти, кипящие по поводу трансгенных животных и растений. Общество разделилось на ярых противников и сторонников создания таких организмов и использования полученных из них продуктов. Есть или не есть продукты из трансгенной сои? Как реагировать на все новые диковинные химеры – картофель, убивающий колорадского жука; землянику, препятствующую образованию инея в саду; персики, растущие за Полярным кругом; коз, дающих вместе с молоком вакцины против болезней? Есть ли предел фантазии ученых, может быть, для них не осталось ничего невозможного?

Чтобы ответить на эти вопросы, попробуем отбросить эмоции и разобраться в том, какие открытия, сделанные на разных этапах развития науки, повлияли на появление в наше время технологий получения трансгенных растений – способов целенаправленного изменения их геномов путем вставки в них генов чужеродных организмов. История открытия – вещь сама по себе интересная. Попробуйте представить, как можно было угадать, куда приведет узкая тропинка событий, скромно вьющаяся по задворкам ботаники, микробиологии, фитопатологии. Можно ли было заранее предположить, что она не оборвется, а выведет ученых на широкую дорогу. Где ее начало?

Пожалуй, корни нужно искать в том времени, когда ученые впервые заинтересовались взаимодействием микроорганизмов и растений. Так мы оказываемся во второй половине XIX в. Немецкий ученый Герман Гельрих 20 сентября 1886 г. делает в Берлине, в Обществе немецких естествоиспытателей и врачей, доклад «В какой форме азот доступен для растений». Результаты его экспериментов доказывают участие в фиксации азота микроорганизмов. Правда, это открытие не стало для ученых большой неожиданностью, оно уже было подготовлено ходом науки, – идея, что называется, носилась в воздухе. Гельриху просто посчастливилось первому доказать то, что большинство ученых уже давно предполагали…

Сделаем еще шаг назад, в век XVIII, и окунемся в развернувшийся уже тогда спор о том, откуда растения берут азот. Английский химик Дж.Пристли и голландец Ян Ингенгус полагают, что они поглощают этот элемент из воздуха, а швейцарский физиолог растений Соссюр и немецкий агрохимик Либих настаивают на том, что растения берут его из почвы. Результаты экспериментов часто противоречат друг другу. Только в XIX в., в 1838 г., французский ученый Жан Батист Бусенго показал, что пшеница усваивает азот исключительно из почвы, а горох и клевер получают его из воздуха. Постепенно выяснилось, что большинство видов растений не могут поглощать азот из воздуха, и только бобовые обладают этой удивительной и полезной способностью.

Таким образом, бобовые растения – особый случай в физиологии растений, случай с непонятными причинами, а возможно, и с перспективами практической пользы! Естественно, внимание ученых было привлечено именно к ним. Загадкой бобовых в XIX в. стали заниматься и университеты, и опытные станции, и частные сельскохозяйственные фермы в Европе и Америке. Какие особенности отличают бобовые от всех остальных растений? На корнях практически всех представителей этого семейства находили не свойственные другим видам многочисленные маленькие вздутия – клубеньки. А в них под микроскопом можно было наблюдать микроорганизмы. Логично было предположить, что клубеньки, микроорганизмы и фиксация азота воздуха как-то связаны, и во второй половине XIX в. появляются многочисленные публикации, в которых высказывается мысль, что клубеньковые бактерии участвуют в азотфиксации. Но предположений мало, требуется экспериментальная проверка. Вот тут-то первым и достигает успеха Герман Гельрих. Спустя короткое время множество ученых в разных странах подтвердили его результаты.

Через два года, в 1888 г., знаменитый голландский бактериолог М.Бейеринк, смог выделить и вырастить чистую культуру азотфиксирующих бактерий. Позднее, по предложению Б.Франка, они получили название Rhizobium (1889 г.).

Еще через два года (1890) А.Празмовский показал, что эта культура удовлетворяет постулатам Роберта Коха о паразитических бактериях. Он вырастил растения гороха на стерильной почве, оказалось, что при таком выращивании клубеньков у них не образуется. Потом ученый заразил выросший без клубеньков горох чистой культурой Rhizobium leguminozarum и наблюдал, как после этого на корнях растений развиваются клубеньки. Из этих клубеньков Празмовский повторно выделил бактерии, которые оказались все теми же Rhizobium leguminozarum.

В то время любого найденного в «чужом» организме микроба было принято считать возбудителем болезни, но этот «паразит» приносил растениям явную пользу – обеспечивал их недоступным для многоклеточных (эукариотических) организмов азотом воздуха. Причем, свободноживущие бактерии Rhizobium leguminozarum не могли фиксировать азот. Таким образом, при заражении меняли свои свойства не только растения, но и сами бактерии. Как потом выяснили, это был один из удивительных примеров настоящего симбиоза – выгоду от совместной жизни получали оба вида организмов.

Хотя конкретные детали этого взаимодействия долгое время оставались неизвестными, это не помешало Ф.Ноббе и Л.Хильтнер, сотрудникам Королевской Саксонской опытной станции по физиологии растений в Таранде (близ Дрездена), попытаться использовать клубеньковые бактерии в биотехнологии. Они заключили контракт с фирмой «Фарбверке Хоэкст» на производство препарата нитрагина – чистой культуры Rhizobium. По их идее, фермеры могли значительно повысить урожай, внося эту культуру в почву. Но затея провалилась – урожай если и повышался, то незначительно. Как выяснилось позже, разные виды бобовых взаимодействуют с разными видами бактерий, о чем тогда также не было ничего известно. (Кстати, когда этот вопрос был достаточно исследован, идея Ф.Ноббе и Л.Хильтнер была-таки доведена в США до практического воплощения и сейчас с успехом используется.) Как бы то ни было, уже в конце XIX в. проблемой взаимодействия бактерий и растений интересовалось не только научное сообщество, но и фермеры, и промышленники.

Однако, несмотря на бурное и многообещающее начало, новые идеи в этой области очень скоро перестали появляться. Всех интересовало, как бактерии фиксируют азот, как взаимодействуют растения и бактерии, но как подступиться к этим проблемам, было неясно. Для их решения не хватало методов современной биохимии и молекулярной биологии. Однако именно этот «застой» вынудил ученых обратить внимание на «менее интересные» факты: а именно, на другие случаи опухолеобразования у растений, например на известные ботаникам корончатые галлы. Многие виды галлов вызываются насекомыми-паразитами, но корончатые галлы возникали явно без их участия. Первыми их исследователями были американский фитопатолог Э.Смит и датский ветеринар К.Енсен. Причем последний заинтересовался корончатыми галлами, изучая образование опухолей у животных (растения служили ему моделью). Енсен показал, что опухоль у свеклы может возникнуть, если заразить растение чистой культурой Agrobacterium tumefaciens. Смиту и его сотруднику Гаунсенду удалось показать то же самое для хризантемы.

Таким образом, был найден еще один интересный случай заражения растений бактериями, причем эти бактерии относились уже к другому роду, а растения были не бобовыми. И хотя при этом на растении также возникало разрастание тканей, на симбиоз бобовых с Rhizobium это явно не походило.

Корончатые галлы

Исследования Енсена и Смита продолжил А.Браун, ставший самым крупным специалистом по корончатым галлам первой половины XX в. Его интересовало, почему клетки здоровой растительной ткани после заражения агробактериями вдруг теряют свои специфические признаки и начинают делиться, образуя бесформенную опухоль. В 1947 г. Брауну удалось обнаружить интереснейший факт, объяснение которому было найдено значительно позже. Пытаясь излечить больное растение, он нагревал его до температуры 46–47 °С, при которой агробактерии погибали, но эта температура была недостаточно высока, чтобы убить клетки самого растения. Казалось бы, после такой процедуры оно должно было излечиться: нет возбудителя болезни – не должно остаться и самой болезни. Но не тут-то было! Опухоль не исчезала, более того, она продолжала расти. Брауну не оставалось ничего, как отметить, что изменения, произошедшие с клеткой, трансформировавшейся в опухолевую, стабильны. После того как бактерии, вызвавшие такую трансформацию, были убиты, автономный рост опухолевых клеток продолжался. Возможной причиной этой стабильности, считал Браун, может быть то, что из бактерии в растительную клетку переносится ДНК. Для превращения нормальной клетки в опухолевую нужно участие не целостной бактерии, а только ее наследственного материала.

Корончатые галлы Напомним, что статью, из которой следовало, что носителем свойств наследственности являются молекулы ДНК (а не белки, как полагали раньше), сотрудник Рокфеллеровского института в Нью-Йорке Освальд Теодор Эвери с соавторами опубликовали всего лишь за три года до этого – в 1944 г. Доказательство их утверждения было основано на строгом опыте, проведенном на двух штаммах пневмококков. Один штамм был способен вызывать пневмонию, а другой – нет. Оказалось, что если к бактериям, не способным вызывать болезнь, добавить погибшие от нагревания патогенные формы, то первые превращались во вторых, то есть сами становились патогенными. Для того, чтобы выяснить, какое вещество служит причиной этого превращения, к культуре безвредных микроорганизмов стали добавлять не целые клетки патогенного штамма, а выделенные из них отдельные фрагменты. Ничто не вызывало волшебного превращения, пока очередь не дошла до ДНК. При ее добавлении произошло то же самое, что наблюдалось при добавлении самих мертвых клеток патогенных кокков, – трансформация, т.е. превращение безвредных бактерий в болезнетворные. Но даже этот результат показался исследователям недостаточно убедительным, и они провели контрольные эксперименты – добавляли ту же самую ДНК, но разрушенную, испорченную. В этом случае изменений не происходило. Но, возможно, к ДНК прикреплялись какие-то молекулы белка, которые и были истинной причиной передачи новых наследственных свойств? Чтобы отпровергнуть и это возможное возражение, препарат ДНК был обработан ферментами, разрушающими белки (протеазами). На трансформацию безвредного штамма в болезнетворный это не повлияло.

Опухоль на корнеплоде свеклы Но вернемся к исследованиям Брауна. Доказать свою смелую гипотезу экспериментально ему не удалось. Эра исследований ДНК только начиналась, результаты сделанных попыток были неоднозначны и оспаривались многими учеными. В конце концов Браун и сам отказался от своего предположения и стал сторонником той точки зрения, согласно которой опухоли растений (да и вообще раковые опухоли) возникают в результате изменений в функционировании генов самих растений и никак не связаны с чужеродным (бактериальным) генетическим материалом.

Опухоль на корнеплоде свеклы

Тем временем последовало сообщение о еще одном открытии, сыгравшем важную роль в возможности современных разработок, но значение которого, как и значение открытия Брауна, тогда осталось непонятным. В 1956 г. Ж.Морель и К.Лиор на заседании Французского общества физиологии растений сделали доклад об обнаружении ими в клетках корончатых галлов неизвестной до сих пор аминокислоты, получившей название октопин (позже выяснилось, что это производное аргинина). В 1960 г. Лиоре и его сотрудники обнаружили в корончатых галлах еще одну необычную аминокислоту, названную лизопин. Значение этих необычных аминокислот было неясно. Поначалу даже разгорелся спор о том, специфичны ли эти они для клеток галловой опухоли или же встречаются и в нормальных тканях растения. Но группе Мореля удалось доказать специфичность октопина, используя очень чувствительный биохимический анализ с участием радиоактивной метки. К 1966 г. были обнаружены в общей сложности уже 4 необычные аминокислоты: октопин, лизопин, октопиновая кислота и нопалин – все это необычное семейство получило название опинов. Рабочая гипотеза исследователей была проста: опины появляются только у опухолевых клеток, значит они – следствие превращения нормальной клетки в опухолевую. Если мы узнаем биохимические реакции, которые приводят к появлению опинов, то узнаем, как клетка становится опухолевой. Причем, конкретный вид опина будет зависеть от метаболизма клеток растений – если метаболические процессы чем-то различаются, то синтезируются различные виды этих аминокислот.

В 1967 г. А.Браун приезжает во Францию, и во время встречи с одним из исследователей опинов – Ж.Тампе ученые придумывают, как проверить эту гипотезу. Если она верна, то чем дальше зашла трансформация нормальной ткани растения в опухоль, тем больше должно в ней накопиться опинов. У Брауна была богатая коллекция культур тканей корончатых галлов. Одна ткань, несмотря на то, что была опухолевой, непрерывно продуцировала почки, из которых затем вырастали побеги. Брауну удалось даже получить из этих почек целые здоровые растения. Другие культуры тканей были полностью опухолевыми. Тампе предположил, что в клетках почек не содержится опинов, а в окружающей их опухолевой ткани этих веществ должно быть много.

Но эксперименты показали, что все клетки образца содержат много опинов. Первое предположение оказалось неверным.

Однако и отвергнутые гипотезы бывают полезны по той простой причине, что дают поле для новых. В данном случае следующим предположением было то, что появление опинов и их вид зависят не от растения, а от бактерии. Причем разные штаммы бактерий будут вызывать появление разных видов опинов. Здесь исследователей ожидал успех. Были найдены штаммы агробактерий, которые поражали разные виды растений, но при этом всегда приводили к появлению в их тканях только октопина. Заражение другим видом бактерий обуславливало синтез только нопалина, т. е. свойства измененной ткани растения зависели именно от свойств поражающих микроорганизмов.

Ученые переключились на эксперименты с бактериями – нужно было понять, чем они отличаются друг от друга. Пытались заставить бактерии синтезировать опины без участия клеток растения, выращивая их на разных культуральных средах. Тщетно. В пробирках бактерии не хотели синтезировать загадочные аминокислоты даже в малых количествах. Пытались найти существенные различия штаммов бактерий по их биохимическим свойствам. Опять неудача. Штаммы, которые отличались друг от друга по характеру воздействия на ткани растения, в пробирках оказывались почти близнецами. Тогда вспомнили о факте, показавшемся поначалу незначительным: в 1968 г. Б.Лежен сообщил о возможности разложения лизопина бактериями. Опины стали добавлять в культуральные среды, и выяснилась интересная вещь – если бактерия вызывает при заражении синтез нопалина, то она может расщеплять только нопалин, бактерии, вызывающие рост октопиновых опухолей, могут расщеплять только октопин и т.д.

Итак, опины синтезируются клетками пораженного растения, но самому растению они не нужны. Их поедают бактерии, вызвавшие опухоль. И в 1970 г. Ж.Тампе вновь выдвигает казалось бы уже отвергнутую гипотезу: при заражении растения бактерией из ее генома в геном растительной клетки переносятся какие-то гены, которые кодируют бактериальные ферменты. Причем эти гены бактерий могут работать в составе генома растения.

Сам Тампе предполагал, что переносятся те самые гены, которые в бактериальной клетке отвечают за расщепление опинов. Согласно его гипотезе, в клетке растения ферментативный путь расщепления преобразуется в путь синтеза, за который отвечают те же самые ферменты. В пользу этого говорил тот факт, что путь синтеза опинов по своим стадиям противоположен пути их расщепления. Для проверки гипотезы достаточно было получить штаммы бактерий, которые в результате мутации утеряли способность расщеплять опины, и заразить ими растения. По идее, они уже не должны были вызывать образование опухолей, поскольку в растительные клетки переносилась «испорченная» ДНК. И опять, как и ранее у Брауна, гипотеза не подтвердилась.

Ключом к решению проблемы стало обнаружение в 1974 г. у агробактерий плазмид – небольших кольцевых молекул ДНК. Это открытие было сделано Генте в лаборатории Дж.Шелла. А Тампе удалось обнаружить, что гены, участвующие в синтезе и расщеплении опинов, находятся как раз в плазмиде. В 1977 г. в Сиэтле М.Чилтон с сотрудниками наконец доказали (при помощи метода гибридизации ДНК), что наследственный материал бактерий действительно переносится в клетки растений и встраивается там в хромосомы. И оказалось, что переносятся как раз фрагменты ДНК плазмиды.

Открытием плазмид у агробактерий заинтересовались многочисленные коллективы молекулярных генетиков, началась настоящая гонка научных исследований – тогда-то и стала обрисовываться перспектива разработки метода получения трансгенных растений. Узкая научная тропинка вывела на широкую дорогу открытий – почти каждое новое исследование шаг за шагом продвигало вперед решение старой проблемы.

В 1978 г. разные группы ученых (под руководством Тампе и Пти во Франции, М. ван Монтегю в Бельгии, Шелла и Холстера в Германии) описали способность Тi-плазмиды (Ti – от tumor-inducing, индуцирующие опухоль) передаваться от одной бактерии к другой путем конъюгации. Причем вызывали эту передачу плазмиды знакомые нам опины.

Выяснилось, что бактерии действительно «заставляют» клетки растений синтезировать опины. Самому растению они, как уже было сказано, не нужны, использовать их они не могут, поскольку у них нет нужных для этого ферментов. Зато такие ферменты имеются у бактерий, заразивших растение, – после этого им уже не надо тратить энергию на добычу пропитания, опухоль больного растения поставляет им пищу в избытке. Это и была разгадка роли опинов.

Были расшифрованы и все детали взаимодействия бактерии и растения при участии Ti-плазмиды. Оказалось, что в растительную клетку переносится не вся плазмида целиком, а только один ее участок (Т-ДНК). В этом участке закодированы гены, заставляющие клетки растения усиленно делиться и синтезировать при этом какой-либо из опинов. Интересно, что эти гены так похожи по своей организации на гены растений, что они беспрепятственно функционируют в геноме растительной клетки, хотя ни один из настоящих бактериальных генов на это не способен.

Агробактерии и растения

* * *

Так завершилась история исследования роли опинов. С этого момента начинается уже другая история – история эры генной инженерии растений. В 1978 г. Шеллом было показано, что Тi-плазмиду можно использовать как переносчик любых чужеродных генов, если только вставить их в область Т-ДНК плазмиды. В том же году эту возможность продемонстрировали Схильперорт и Ледебур в Голландии, а позже, в 1980 г., Нестер и Чилтон в США. С этого началась не только новая дорога научных поисков, но и новая эра в развитии сельского хозяйства и мировой экономики.

Литература

Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. – М: Мир, 1976.

Методы генетики соматических клеток //Под ред. Дж.Шелл. Т.2. – М.: Мир, 1985.

Тампе Ж., Пти А. Тропа опинов // Молекулярная генетика взаимодействия бактерий с растениями. – М.: ВО «Агропромиздат», 1988 г.

Хойман У. Исторический обзор изучения взаимодействия бактерий с растениями // Там же.