Апоптоз

Многие ученые полагают, что Нобелевскую премию 2002 г. Сиднею Бреннеру, руководителю Британского отделения международного проекта «Геном человека», присудили за успешное завершение этого проекта. Однако сам лауреат считает, что главной его научной заслугой является выявление нового модельного организма для молекулярно-биологических исследований – пoчвeнной нематоды Caenorhabditis elegans. Бреннер также гордится тем, что геном этой нематоды был первым расшифрованным геномом многоклеточного животного.

В своей книге «Моя жизнь в науке», вышедшей в 2001 г., Бреннер писал, что ценорабдитис – идеальный объект с точки зрения генетика: имеет сексуальную жизнь, небольшую нервную систему и ограниченное количество клеток, потомство которых легко прослеживается в полупрозрачном тельце длиной не более 1 мм. Первая его статья на эту тему появилась в 1972 г., и с той поры число публикаций разных авторов перевалило за 3 тысячи.

Джон Салстон, ученик Бреннера, подсчитал количество клеток нематоды, которое оказалось равным 959. В ходе этой работы он обнаружил, что некоторые клетки, общим числом 131, в процессе развития организма отмирают. Если это закономерное отмирание нарушить, то нарушается развитие организма.

Изучением ценорабдитиса занимался и американец Р.Горвиц, ныне сотрудник Массачусетского технологического института. Ему удалось обнаружить гены клеточной смерти, получившие название «сed» (от англ. cell death – смерть клетки). Открытие этой генной системы ознаменовало собой самый настоящий переворот в биологии.

Основываясь на первых экспериментальных фактах, Салстон в 1972 г. теоретически сформулировал концепцию естественного противовеса клеточному делению – митозу. «Митотический антоним» получил название апоптоза. Это слово в греческом языке означает опадание листьев, происходящее в связи с осенним умиранием природы. Официально апоптоз переводится как «запрограммированная смерть клетки».

Согласно одной из теорий, митохондрии являются внутриклеточными симбионтами, родственниками эубактерий, отделившимися от предков нынешних настоящих бактерий несколько ранее хлоропластов. По всей видимости, внутриклеточные симбионты поначалу вели себя не столь «корректно», как сейчас, и им приходилось защищаться от враждебного окружения. Вот почему первая апоптическая генная система связана именно с митохондриями.

При поступлении сигнала апоптоза целостность митохондриальной мембраны нарушается, в результате чего из нее высвобождается весьма агрессивный белок – цитохром с. Из матрикса митохондрии в цитоплазму клетки в большом количестве попадают еще более агрессивные оксиданты – кислородные радикалы. Все это приводит к активизации специфических протеаз –каспаз.

Протеазы – это ферменты, которые расщепляют полипептидные цепи белков. Каспазы разрезают белковую цепь между остатками цистеина и аспарагиновой кислоты. Однако этим их фунции не ограничиваются. Активация каспаз в ядре приводит к разрушению ингибитора другого фермента, CAD-каспаз-активированной ДНКазы, в результате чего он активируется и разрушает ДНК в ядре.

С момента поступления апоптозного сигнала и до гибели клеток обычно проходит не более 48 ч.

Включение генетической программы апоптоза под действием внешних сигналов

Считается, что в регуляции апоптоза, как и в других сложных внутриклеточных процессах, используется система взаимосвязанных «рычагов и противовесов». Одним из противовесов апоптоза является белок Bcl, мутации в гене которого были обнаружены сначала при В-клеточной лейкемии.

Лейкемия – это рак крови, при котором значительно возрастает число лейкоцитов – клеток, призванных защищать нас от болезней. Заболевание возникает вследствие нарушения апоптоза лейкоцитов, в результате чего клетки делятся, но не умирают.

Среди лейкоцитов выделяют лимфоциты, которые делятся на Т- и В-клетки. Т-лимфоциты оберегают нас от раковых клеток, которые постоянно образуются в организме, а также от чужеродных клеток органов и тканей, если их пересаживают (реакция отторжения). В-лимфоциты синтезируют защитные белковые антитела.

В статье, опубликованной в Nature 20 ноября 1997 г., Горвиц писал: «У цэнорабдитиса есть ген ced-9, который является аналогом гена ингибитора клеточной смерти млекопитающих bсl-2». Сходные по своей функции гены у явно несходных организмов называют ортологами (у сходных организмов, например у мыши и человека, такие гены называют гомологами). Спустя 5 лет ученые выяснили, что белок Bcl может запускать апоптоз и без участия цитохрома с, активируя каспазы напрямую. Интересно, что мутантный белок Bcl человека может подавлять апоптоз у Caenorhabditis elegans. Вот до чего могут быть близки по функции эволюционные ортологи…

Очень важным регулятором «судьбы» клеток является белок Р53. Этот протеин является продуктом гена-протектора, защищающего наши клетки от раковой трансформации. При накоплении в ДНК определенного количества ошибок (мутаций) белок Р53 либо вызывает приостановку клеточного цикла, либо включает апоптоз. Белок Р53 требуется для апоптоза в развивающейся нервной системе, а также для «наведения порядка» после облучения клеток. Естественно, что при мутациях в гене белка Р53 возникают самые разные опухоли.

Свою «надзорную» функцию за повреждением ДНК белок Р53 осуществляет в тесном взаимодействии с транскрипционным фактором Мус (мик), ген которого был выделен впервые в мутантном виде при миелоцитоме (вид рака крови). Транскрипционные факторы, как известно, запускают транскрипцию, или считывание генов. Мус «садится» на промотер (регуляторную часть гена) гена Р21^Cip – ингибитора киназы, «запускающей» митоз, в результате чего блокирует клеточное деление. А далее уже Р53 «решает» судьбу клетки: исправлять ли ошибки, возникшие при удвоении ДНК, или стимулировать апоптоз.

Регулируется апоптоз и в ядре. Так, в нитях веретена деления есть особый белок, который также может вызвать апоптоз. Но более важным регулятором являются теломеры хромосом и фермент теломераза.

Предполагаемая схема начала развития диабета

Напомним, что теломеры, или концевые участки хромосом, характеризуются одноцепочечной ДНК, которая с каждым митозом укорачивается на 300–400 нуклеотидов. При образовании половых гамет теломераза восстанавливает длину теломер, «омолаживая» клетки. Одноцепочечная ДНК теломеры защищена особыми белками, которые предохраняют ее от расщепления. При мутации Est (ever shortening telomere – вечно укорачивающаяся теломера) этот нежелательный процесс все же происходит, что ведет к раннему апоптозу. Таким образом, мы видим, что и сами хромосомы могут, в какой-то мере, регулировать процесс перехода клетки к апоптозу.

Схематически апоптоз можно изобразить так:

Мус Р53

Апоптический сигнал --> (Всl) Митохондрия–Цит С --> Каспазы --> ДНКаза --> Теломеры

Теория апоптоза воспринимается с трудом, пока не познакомишься с тем, к чему конкретно приводит это важное биологическое явление. Поэтому приведем несколько примеров.

Апоптоз открыли у развивающегося червя. Развитие эмбриона невозможно без апоптоза. Дело в том, что органогенез, т.е. возникновение органов, требует постоянных перестроек, которые немыслимы без вызываемой различными сигналами клеточной смерти.

В норме в нейробластах формирующегося головного мозга мышей под действием белка Wnt активируется белок бета-катенин. Отключение Wnt приводит к рождению мышат-«циклопов» с одним глазом во лбу. Ученые Гарвардского университета решили «помочь» развитию мышат, создав суперактивньй бета-катенин. Для этого они отрезали первые 90 аминокислот бета-катенина, которые необходимы для взаимодействия с Wnt, и катенин больше не нуждался в этом регуляторе для своей активации.

Такая молекулярная операция привела к нарушению апоптоза в нервных клетках, в результате чего мышата рождались с головой в 2 раза больше нормы и огромным мозгом, поверхность которого была испещрена бороздами и извилинами (что характерно только для человека – может мы возникли в результате мутации гена бета-катенина?).

Упомянутый выше транскрипционный фактор Myc также регулирует размер органов и всего организма. Выключение Мус приводит к внутриутробной гибели мышат, у которых обнаруживается гипоплазия (недоразвитие органов) и отсутствие эритроцитов. При этом размер клеток не изменяется, уменьшается лишь их число.

Выключение гена каспазы у мышей является причиной внутриутробной гибели развивающихся мышат. У человека этот дефект частично компенсируется. Мутации в генах каспаз вызывают у человека невирусный иммунодефицит.

Специалисты Национального института здоровья в Вашингтоне обследовали семью со здоровыми гетерозиготными родителями, но больными детьми. У детей отмечались постоянные воспаления легких и герпетические поражения слизистых. «А при чем тут апоптоз?» – спросит читатель.

Дело в том, что нефункциональные иммунные клетки подвергаются в нашем организме апоптозу. Если этот процесс не идет, кровоток «засоряется» нефункционирующими клетками, что и приводит к иммунодефициту.

Апоптические клетки уничтожаются макрофагами. При встрече с макрофагом у здоровых и активных клеток включается синтез фосфатов, благодаря чему они «отталкиваются» от иммунной клетки. В клетке же, подвергающейся апоптозу, такой синтез не запускается, что и является для макрофага сигналом к «сцеплению» с умирающей клеткой и поглощению ее, чтобы токсические вещества не отравили окружающих.

Спермии тоже подвергаются апоптозу

И последний пример. Есть в наших клетках так называемый апоптоз-индуцирующий фактор (АИФ). Его функция заключается в стимулировании апоптоза при поступлении соответствующего сигнала. Действует этот белок, «обрабатывая» клетки перекисью водорода. После взаимодействия с АИФ нейроны головного мозга приобретают явные признаки окислительного стресса. У людей подобная картина наблюдается при амиотрофическом склерозе нейронов спинного мозга, паркинсонизме, болезни Альцгеймера и гибели сетчатки.

АИФ представляет собой белок флавопротеин с пиридиновым нуклеотидом. Белок имеет такой же окислительно-восстановительный домен, как у H₂O₂-перерабатывающих ферментов бактерий. В обычных условиях АИФ локализуется между мембранами митохондрий, а после апоптозного сигнала перемещается в цитоплазму и ядро клетки. Действует АИФ независимо от каспаз и Всl.

Выключение гена АИФ у мышей приводит к снижению апоптоза и увеличению частоты митозов. Мутация гена, вызванная вставкой вирусного генома в ген АИФ, приводит к рождению мышек-малюток «Арлекин», у которых экспрессия гена снижена на 80%. В возрасте до 3 месяцев такие мыши неотличимы от нормальных, но затем начинаются аномалии, вызванные гибелью нейронов мозжечка. Уже в 4 месяца под микроскопом видно много погибших клеток зернистого слоя, от которых зависит способность удерживать равновесие (для этих мышей характерна неуверенная походка), а в 7 месяцев мозжечок мышей Арлекин становится меньше нормального.

Апоптоз был открыт как удобная модель для теоретических исследований молекулярной биологии. Сегодня он уже стал внедряться в практику. Осталось научиться использовать его для лечения людей.