Биологические часы

В XVIII в. было естественно работать в разных научных направлениях – это был стиль еще недавнего Ренессанса. Ученый секретарь Парижской королевской академии наук де Мэран был астрономом и математиком. Он вел переписку со многими выдающимися исследователями разных стран. Тогда не было журналов, и о научных результатах сообщали друг другу в письмах и обобщали их в мемуарах и диссертациях. В 1729 г. де Мэран сообщил о замечательном наблюдении.

Кто сейчас, когда значительная часть жителей нашей страны имеет огороды, не видел, как растет фасоль? Все видели. А кто замечал, что ночью фасоль опускает листья, а перед рассветом поднимает? Мало кто это видел – что за фантазия идти ночью на огород смотреть на фасоль!

Эти «никтинастические» движения листьев заметил де Мэран. И он сделал важнейший опыт: поместил фасоль в темную комнату – в темноту и днем и ночью – и наблюдал, что движения листьев продолжаются и без изменения освещенности: поднимаются, когда наступает день (а в комнате все равно темно) и опускаются ночью. Как листья определяют, что там, «на воле», день или ночь? У них есть часы? Может быть, фасоль чувствует изменения температуры?

У многих растений листья располагаются перпендикулярно солнечным лучам и стеблю днем и параллельно стеблю ночью. Эти движения «засыпания» можно зарегистрировать на вращающемся барабане с помощью специально закрепленного пера (А). У многих растений, таких как обыкновенная фасоль, листья продолжают эти движения в течение нескольких дней даже при непрерывном тусклом освещении. (Б) – запись этого циркадинного ритма, в условиях непрерывного тусклого освещения

Термостатов тогда не было. В 1758 г. Дюмель повторил опыты де Мэрана, поместив растения в глубокую пещеру – во мрак, где температура была неизменна и днем и ночью. Движения листьев продолжались (постепенно, через много дней, эти движения затухают, но от очень короткой вспышки света движения возобновляются, причем так, как будто все время часы шли, только листья-стрелки не двигались).

Прошло 270 лет с открытия де Мэрана. Проблема биологических часов трудами десятков выдающихся исследователей весьма разных специальностей близка к разрешению.

Внутриклеточные ритмы

Что мы знаем о биологических часах сейчас, в начале XXI в.? Знаем, что они есть в каждой клетке, что в многоклеточных организмах все часы всех клеток должны идти согласовано, образуя иерархическую систему: часы отдельных клеток управляются часами органа, часы всех органов настраиваются по часам центральной нервной системы (если она есть), а в ней – в мозге – есть главные часы организма. Знаем, что биологические часы активны (в отличие от солнечных часов) и эндогенны, т.е. они «идут» сами – внутри каждой клетки есть свой «маятник», «колебательный контур», периодический процесс, отмеривающий единицы времени. При этом ход внутриклеточных часов, как и ход искусственных, рукотворных? часов, можно подстраивать по фазе – «подводить стрелки» соответственно с периодическими процессами окружающей среды, прежде всего суточным вращением Земли.

«Часовой механизм», как и полагается особо ценному имуществу, передается по наследству – в клетках есть гены часов. Эти гены, как и любые другие, подвержены мутациям и, следовательно, естественному отбору.

Мы, в основном, понимаем, зачем нужны часы в клетках – ясно, что для согласования жизнедеятельности со сменой дня и ночи, т.е. в качестве приспособления к вращению Земли вокруг своей оси. А поскольку в средних и высоких широтах соотношения светлого и темного времени в течение года не одинаковы, часы необходимы и для приспособления к смене времен года, т.е. для приспособления к наклону земной оси относительно плоскости орбиты. Тут мало измерить соотношение светлого и темного времени суток, нужно еще знать, растет или убывает день (ночь) – иначе можно спутать весну и осень.

Часы нужны и тем, кто должен учитывать лунные ритмы. Это, прежде всего, обитатели приливных зон побережий океанов. Время «высокой воды» или «низкой воды» изменяется из-за несовпадения лунных и земных суток. Учет сдвига времени приливов и отливов невозможен без точных внутренних часов. Понятно и назначение иерархического подчинения часов в многоклеточном организме – организм должен функционировать как целое: рассогласование функций органов и тканей приводит к различным болезням.

Без часов нельзя решить задачи навигации. Заметив, что богатые нектаром цветущие растения растут под определенным углом относительно положения Солнца, пчелы при повторном полете за нектаром должны делать поправку на движение Солнца. Для этого нужны часы. Умеют вносить поправку на время суток и птицы, ориентируясь в перелетах ночью по звездам или днем по Солнцу.

Нет, не все тут понятно! Зачем морским одноклеточным жгутиконосцам – например пиридинеям, гониаулаксу (Gonyaulax), знать, что наступила ночь? Они светятся ночью и не светятся днем. Какой в этом смысл? Кому они подают световые сигналы и зачем? Зачем часы примитивному грибу нейроспоре? Ясно, что часы им нужны – иначе они не сохранились бы при естественном отборе. А зачем нужны? Не знаем, зато известно, что это бесценные объекты для изучения природы часов.

Что мы знаем о природе биологических часов? Откуда следует, что они эндогенны, что их ход не определяется каким-то внешним периодическим процессом?

Де Мэран показал, что дело не в периодической смене дня и ночи. Дюмель – что дело не в периодических изменениях температуры. Но они, не имея точных приборов, могли не заметить небольших изменений. Кроме того, может быть, дело в каких-то других, физических, факторах – атмосферном давлении, электромагнитных трудно экранируемых излучениях или, вообще, в каких-то еще неизвестных излучениях Солнца?

Главный довод в пользу эндогенности состоит в следующем. В постоянных, по всем параметрам контролируемых условиях, период внутриклеточных часов вовсе не равен ровно 24 ч. Такой «свободный» период может быть и 22 (и даже 16), и 28 ч. Это лишь, как говорят по предложению Халберга, «циркадный» (околосуточный) период.

Циркадные, собственные, эндогенные часы подстраиваются внешними периодическими процессами под 24-часовой период земных суток. Но их можно подстроить и под другие периоды – растянуть до 48 ч или сжать до 16 ч. Это делают в искусственных условиях с растениями, животными, человеком, когда изучают поведение часов в условиях, имитирующих, например, условия длительного космического полета или подводного плавания.

Итак, основной механизм часов – внутри клетки. Как устроен этот механизм? Чтобы выяснить это, нужно ответить на несколько вопросов.

Первый вопрос: для измерения времени нужен какой-то периодический процесс – «маятник». Что за маятник используется в клеточных часах, и какова точность их хода? Точность часов определяется самым высокочастотным процессом в их механизме. Живым организмам вряд ли нужна точность выше, чем несколько секунд в сутки. Значит, должен быть процесс с периодом колебаний порядка секунд. Какой это процесс? (Пчелы и птицы вносят поправки на движение Солнца или вращение звездного неба, т.е. Земли, с точностью до нескольких минут.)

Второй вопрос: как обеспечивается независимость хода часов от температуры? Ход часов не должен зависеть от температуры. Уж очень непостоянна температура среды обитания. Независимость от температуры – очень трудное условие поиска: все химические процессы и большинство физико-химических процессов сильно зависят от температуры.

Третий вопрос: как осуществляется преобразование высокочастотного процесса в низкочастотный? В наших механических часах преобразования от секундных колебаний маятника (секундная стрелка делает оборот за 1 мин) к движению минутной стрелки (оборот за 1 ч) и 12-часовому обороту часовой стрелки осуществляются посредством делителей частоты – системы шестеренок. Как в биологических часах осуществляется преобразование околосекундных колебаний в околосуточные?

Четвертый вопрос: как происходит регулировка и подстройка часов относительно внешних периодических процессов («сигналов точного времени»)? Должны быть «рецепторы», воспринимающие эти внешние сигналы, например световые импульсы.

Остается еще много важных вопросов и среди них такой: как осуществляется «временная организация» – согласование всех внутриклеточных часов многоклеточного организма? Такое согласование предполагает какую-то систему сигнализации между клетками. А тогда возникают новые вопросы: что за сигналы посылают они друг другу? Как достигается иерархия – подчинение часов одних клеток сигналам часов других, «руководящих», клеток? Где в клетке находятся часы? Где в многоклеточном организме со сложной анатомией находятся главные часы?

Исследованием природы биологических часов заняты лаборатории в разных странах. Здесь работали и работают выдающиеся исследователи: «классики» Фриш, Бюннинг, Питтендрич, Хастингс, Халберг, и много новых, относительно молодых биологов, физиков, математиков. Далеко не на все перечисленные вопросы получены ответы, и все же успехи здесь замечательны.

Биохимические колебательные процессы и внутриклеточные часы

Итак, мы должны определить природу внутриклеточного периодического процесса, не зависящего от температуры, имеющего период порядка секунд, колебания которого преобразуются в околосуточные. Процесс этот должен настраиваться по внешним ритмам (свет–темнота) и по сигналам, идущим от других клеток многоклеточного организма.

В середине 1950-х гг. мысль о возможности существования колебательных, периодических химических (биохимических) реакций казалась очень странной. Как это может быть, чтобы в химической реакции все молекулы реагировали то с одной скоростью, то с другой, т.е. были бы все то в одном, то в другом состоянии? Казалось, что это допущение противоречит законам термодинамики.

И в самом деле, в равновесии колебания невозможны. Но колебательные процессы осуществляются лишь до тех пор, пока системы неравновесны, пока не израсходована их свободная энергия. Пока концентрации реагентов неравновесны, колебательные режимы вполне возможны. Но это простое соображение долго не осознавалось даже очень образованными людьми. Поэтому, когда работавший в секретном учреждении военный химик генерал Борис Павлович Белоусов послал в 1951 г. в редакцию одного из журналов статью с описанием открытой им периодической реакции, статью ему вернули с обидной рецензией: такого не может быть!

А реакция, открытая Б.П. Белоусовым, замечательная – в растворе серной кислоты малоновая, лимонная, яблочная кислоты окисляются в реакции с KBrO₃ в присутствии катализатора – ионов церия (или марганца, или железа). Если для большей наглядности в реакционную среду добавить комплекс железа и фенантролина, цвет раствора периодически изменяется от ярко-синего до красно-лилового и обратно. Глаз не отведешь! Наблюдающие эту реакцию даже дышать начинают невольно в такт изменениям цвета. Но рецензенты были настолько убеждены, что этого быть не может, что не захотели поставить несложный опыт. Зачем, когда и так ясно...

Ко времени открытия Б.П. Белоусова математическая теория колебательных реакций была уже создана (в 1910 г. Альфредом Лоткой). У нас в стране выдающиеся физики Л.И. Мандельштам, А.А. Андронов и их последователи создали общую теорию колебаний. Д.А. Франк-Каменецкий и И.Е. Сальников открыли и описали колебательные процессы в реакторах, когда происходят не только химические превращения, но и диффузия и передача тепла на стенках реактора. Все это могло служить моделями внутриклеточных колебательных процессов. Оставалось «немногое» – найти их в клетках.

Сообщения об открытии биохимических колебательных процессов начали появляться с конца 1950-х гг. (в том числе из нашей лаборатории). Однако первый бесспорно периодический биохимический процесс открыл выдающийся американский биохимик Бриттен Чанс.

Во всех клетках превращения энергии связаны с синтезом и гидролизом АТФ. Самый распространенный процесс, в котором в темноте и без кислорода образуется АТФ, – это гликолиз, когда происходит расщепление молекулы глюкозы на две молекулы молочной кислоты или на две молекулы этилового спирта и две молекулы СО₂ (тогда этот процесс называется брожением). Гликолиз – это последовательность многих реакций, каждая из которых катализируется своим ферментом. Центральная реакция гликолиза (в ней фруктозо-6-фосфат превращается во фруктозо-1,6-бифосфат) катализируется ферментом фосфофруктозокиназой. Вот в этой реакции и были обнаружены колебания скорости. Следовательно, и синтез АТФ должен был осуществляться с колебаниями скорости: то быстрее, то медленнее. И колебания были «вполне подходящие», с периодом порядка минуты, т.е. вполне годились на роль маятника биологических внутриклеточных часов.

Казалось, что механизм биологических часов – их маятник – найден. Однако вскоре наступило разочарование. Эти колебания в гликолизе идут лишь в особых условиях и, кроме того, сильно зависят от температуры. А часы от температуры зависеть не должны. В разных лабораториях продолжали поиск.

Гликолиз – это бескислородное окисление глюкозы, дающее всего две молекулы АТФ на одну молекулу превращенной в молочную кислоту глюкозы. А в митохондриях, осуществляющих внутриклеточное дыхание, образуется 34 молекулы АТФ на каждую окисленную до CO₂ и H₂O молекулу глюкозы. Вот если бы здесь был колебательный процесс, он должен был бы быть значительно более эффективным часовым механизмом.

Колебания в митохондриях были найдены – М.Н. Кондрашовой и Ю.В. Евтодиенко в лабораториях Института биофизики в Пущино. В ходе этих колебаний в митохондрии то входят потоки ионов калия, кальция или водорода, то выходят. Скорость поглощения кислорода митохондриями также периодически изменяется. Теперь найден механизм, точнее маятник, часов? К сожалению, нет. Все еще было не ясно – происходят ли эти колебания, как должно быть в часах, всегда, или только в определенных создаваемых в эксперименте условиях. И, опять же, выяснилось, что они сильно зависят от температуры.

Пришлось задуматься: следует ли искать механизм часов в процессах, обеспечивающих клетки энергией? Все больше данных свидетельствовало в пользу того, что часы идут в полном покое, когда энергия почти не расходуется, так же, как и при активной жизнедеятельности.

Пчел на зиму укрывают от морозов и света, они цепенеют в своих темных ульях. А часы у них «идут» всю зиму, и весной пчелы правильно определяют время суток, что необходимо им для правильного выбора направления полета к цветущим растениям за «взятком».

Охлаждаются и цепенеют при температуре, близкой к 0°С, повисшие вниз головой в темных пещерах летучие мыши. Проходит много месяцев до теплых летних ночей (все это время у них правильно идут часы), и в нужное время они вылетают на ловлю ночных насекомых.

Не сбиваются с нужной фазы и околосуточные периодические процессы у растений, помещенных на много недель в темноту при постоянной температуре. Внешне нет никаких проявлений хода часов, движения «стрелок» не видно. Но дайте краткую вспышку света, и окажется, что все это время часы правильно отсчитывали время: у фасоли листья будут опускаться или подниматься так же, как и у контрольных растений, бывших при нормальной смене дня и ночи (это упрощенная картина).

Часы идут даже при почти полной остановке метаболических процессов. В этих исследованиях важные результаты дает применение различных ядов–ингибиторов биохимических процессов.

Я уже упоминал морской одноклеточный организм Gonyaulax. Он светится ночью, следуя своим внутриклеточным часам. Всем известная зеленая эвглена, наоборот, ночью неактивна. Днем она активно плывет в сторону большей освещенности, проявляет положительный фототаксис. Свет необходим ей для фотосинтеза. Ночью, если направить на сосуд с эвгленами узкий луч света, они на него не реагируют, фототаксиса не проявляют. Наступление дня и ночи зеленая эвглена определяет по своим внутренним часам.

Если добавить в воду, где живут эти организмы, метаболические яды, останавливающие дыхание и гликолиз, жизнедеятельность их замирает, эвглены перестают двигаться, гониаулаксы не могут генерировать свет. Если перенести их в свежую среду, отмыть яды, жизнедеятельность восстанавливается. Но самое замечательное: оказывается, что все это время их часы шли вполне правильно, как будто бы клетки и не отравляли: после отмывания ядов они вовремя начинают испускать свет и вовремя проявлять способность к фототаксису. Но если добавить в воду яды, нарушающие процессы считывания генетической информации, например, актиномицин Д, препятствующий функционированию РНК-полимеразы – синтезу мРНК по матрице ДНК, – часы сбиваются, ход их нарушается. Эти наблюдения сделаны в 1960-х гг. американским исследователем Гастингсом.

Однако найти реакции синтеза белка в клетке с колебаниями скорости с периодом порядка секунд не удалось, а именно такие колебания нужны для обеспечения должной точности часов. И, вообще, после периода общего увлечения колебательными биохимическими процессами наступило (как обычно бывает) «охлаждение чувств». Колебательные режимы биохимических процессов стали казаться экзотикой, проявляющейся лишь в особых условиях. Но вот в последние годы интерес к этим процессам вновь пробудился.

Продолжение следует