И.Э.ЛАЛАЯНЦ

Очерки о геномике

Компаративная геномика

На рубеже XVIII и XIX вв. барон Жорж Кювье создал свою знаменитую сравнительную, или компаративную, анатомию. Он утверждал, что по одной косточке может воссоздать если не внешний облик, то целый скелет вымершего животного. Барон, конечно же, блефовал, но, тем не менее, определенные результаты сравнительный (компаративный) анализ дал.

В наши дни область применения сравнительного анализа расширилась до молекулярного уровня: сравниваются уже геномы организмов, что позволяет установить их филогенетическое родство. В распоряжении ученых имеются геномы представителей основных классов позвоночных – рыб, курицы и нескольких видов млекопитающих. Это позволяет говорить о рождении новой науки, а именно сравнительной, или компаративной, геномики, дающей уникальную возможность проследить в эволюционной перспективе развитие всех позвоночных.

Рыбы и их геномы неизменны вот уже на протяжении полумиллиарда лет. Предки млекопитающих отделились от общего «ствола» еще в конце палеозоя, в то время как птицы являют собой пример относительно молодого и успешно развивающегося класса. Их предки отделились от археозавров в конце юрского периода в мезозое.

Сравнение геномов разных классов позвоночных позволяет точнее определить специфичность их функциональных элементов, как кодирующих, так и некодирующих. Оказалось, что многие консервативные некодирующие последовательности находятся на достаточном удалении от генов, отвечающих за синтез того или иного белка. Сравнение групп сходных генов – ортологов – выявляет процессы, которые характерны для отдельных линий позвоночных на протяжении сотен миллионов лет раздельной эволюции.

Геном птицы оказался значительно меньше геномов млекопитающих, имеющих около 3 млрд нуклеотидов. В нем значительно меньше рассеянных в его «тексте» повторов, псевдогенов и сегментарных дупликаций, что характерно для геномов млекопитающих. Есть различия и в эволюции генов, отвечающих за синтез многочисленных РНК.

В то же время сами гены в обоих классах собраны в длинные блоки консервативных наборов. Похоже, что геном в ходе эволюции формировался из заранее заготовленных блоков, между которыми располагались какие-то еще не совсем понятные по своей функции некодирующие последовательности.

У курицы диплоидный набор составляет 78 хромосом. В нем довольно много пар, представленных микрохромосомами с размерами от 5 до 20 млн нуклеотидов (мегабаз, Мб). Такие же микрохромосомы есть у некоторых других птиц, рыб и рептилий. В отличие от млекопитающих у птиц особи женского пола имеют разные половые хромосомы – ZW, в то время как у самцов они одинаковы – ZZ. Общий размер генома курицы составляет всего 933 Мб.

С помощью митохондриальной ДНК было подтверждено предположение Дарвина о том, что предками домашних кур были дикие куры рыжего окраса и ныне обитающие в азиатских джунглях. У курицы с млекопитающими совпадают более 20 тыс. генов, но с генами человека функционально сходны менее 10%.

Nature, 2004, № 7018.

Геном и мозг

К формированию генома можно подходить, как к игре в своеобразный конструктор. Геномы многоклеточных животных состоят из нескольких тысяч элементов, кодирующих тот или иной белок, а у растений, по крайней мере у риса и кукурузы, таких элементов раза в два больше. Это различие в численности генов, возможно объясняется тем, что растения не могут убежать от врагов, поэтому вынуждены защищаться от них на месте. Вероятно, в будущем найдется и более серьезное биологическое объяснение этому различию.

Ученым Гарвардского университета удалось выделить в геноме мыши почти 1445 генов так называемых транскрипционных факторов (ТФ) – особых белков, запускающих транскрипцию генов. Эти факторы не только тканеспецифичны, но и действуют на разных стадиях эмбрионального развития. Из выделенных ТФ 1174 оказались специфичными для мозга, что позволило картировать места экспрессии их генов.

Больше половины из них оказались белками с «цинковыми пальцами», т.е. боковыми петлями, стабилизированными ионами цинка, каждый из которых связан с четырьмя аминокислотными остатками (обычно цистеина или гистидина) в основании петли. Обнаружены и факторы Нох, или гомеобокса, одной из древнейших систем регуляции сегментарного развития, открытые сначала у дрозофилы, а затем и у остальных организмов. Гены Нох отвечают за сегментацию трех эмбриональных пузырей переднего отдела нервной трубки, из которых затем развивается головной мозг, а также за разделение на отдельные сегменты спинного мозга и отходящих от него периферических нервов.

Было выделено 50 генов так называемых ядерных гормональных рецепторов. Это тоже специфические белки, связанные с регуляторными участками генов, которые активируют работу гена-мишени при поступлении в ядро того или иного гормона. Особенно активны эти ТФ в период полового созревания.

В общей сложности удалось выделить 33 больших семейства ТФ. В одно из них входят факторы, молекулы которых имеют раздвоенную наподобие вилки головку – Forkhead, или сокращенно Fох. К этому классу относится, например, фактор Fох Р, который управляет развитием нервных клеток, отвечающих за язык и речь. Другой ТФ из класса Fох регулирует продолжительность жизни клеток (и всего организма) на фоне умеренного голодания (известно, что голод вызывает увеличение средней продолжительности жизни организмов). Достигается это за счет того, что этот ТФ включает ген SIRT (от Starvation Induced – индуцируемый голоданием), который кодирует фермент деацетилазу. Этот фермент отщепляет остатки уксусной кислоты, что в свою очередь стимулирует экспрессию других важных для жизнедеятельности клеток генов. При выключении гена Fox у мышей не наблюдается увеличение продолжительности жизни на фоне ограничения калорийности питания (снижения содержания жиров вдвое).

Картирование экспрессии генов различных ТФ показало, что, например, в сетчатке развитие и плотность ганглионарных и амакриновых клеток определяется разными факторами. После рождения мышат у них в мозжечке специфические ТФ отвечают за синтез особого ламинарного («слоевого») белка, по наличию которого можно различить зрелые и незрелые гранулярные клетки и клетки Пуркинье, управляющие нашими движениями и положением в пространстве.

Транскрипционный фактор Оlig требуется для нормальной работы олигодендроцитов, «окутывающих» нервные волокна миелиновой оболочкой. Роль ТФ заключается в правильном «избрании» пути дифференцировки, т.е. направлении незрелых предшественников по пути их превращения в миелинизирующие клетки и правильной реализации необходимых для этого генетических программ. С неправильным функционированием этих ТФ связаны такие демиелинизирующие заболевания, как рассеянный склероз.

Science, 2004, № 5705

Зачем нам нужны онкогены?

Одним из эпохальных открытий молекулярной онкологии второй половины 70-х гг. ХХ в. было то, что онкогены, или раковые гены, находятся в геноме клетки, а вовсе не приносятся вирусами. Перед учёными встали новые вопросы: что делают раковые гены в клетках и почему в то же время далеко не все люди заболевают раком?

Ответы на оба вопроса были найдены довольно быстро. Оказалось, что так называемые онкогены – это обычные клеточные гены, которые отвечают за синтез каких-то белков. На раскрытие функций этих белков ушли два последних десятилетия прошлого столетия, и эти работы во многом стимулировали геномные исследования.

Возникающие время от времени мутации в онкогенах приводят к тому, что соответствующий белок оказывается нефункциональным, в частности перестает сдерживать сигналы, подталкивающие клетку к делению. Так постепенно происходит малигнизация клетки – превращение ее в злокачественную, способную к неконтролируемому делению. Ярким примером таких клеток являются ставшие знаменитыми стволовые клетки.

Стволовая клетка в костном мозге

Стволовые клетки закладываются еще на стадии первых делений зиготы, в результате которых образуется морула. На следующей стадии, бластуле, внутри «шарика» уже есть внутренняя масса из 20–30 клеток, которые называют эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК). Некоторые из этих ЭСК или их ближайших потомков могут сохранять свой потенциал (способность к делению и дифференцировке) до глубокой старости организма.

На каждой стадии развития и в каждой ткани сейчас открыты свои собственные стволовые клетки. Способность стволовых клеток к дифференцировке быстро снижается с каждым делением. Поэтому, например, гемопоэтические (ответственные за кровообразование) стволовые клетки, имеющиеся в костном мозге, могут давать только клетки крови, да и то не все. Так, например, из эритробластов образуются только эритроциты.

Известно, что у эмбриона кроветворение начинается в последней трети беременности, причем не в костном мозге, а в печени. Именно вытяжками из печени абортированных эмбрионов пытались в свое время лечить жертв Чернобыля. Удивительно, что центрами эмбрионального образования эритроцитов в печени служат макрофаги – Купферовы клетки, у которых в гипертрофированной цитоплазме содержатся вакуоли с эритробластами (это явление называется эмпериполезисом). Пока не вполне ясно, как эритробласты попадают внутрь макрофагов.

Пример эмпериполезиса. Срез печени 16-дневного эмбриона крысы.
Стрелками показаны макрофаги, содержащие эритробласты

А.Явароне из Колумбийского университета в Нью-Йорке попытался определить роль онкогена RB в эритропоэзе у эмбриона. RB был выделен у детей с ретинобластомой (опухолью сетчатки). Одна из основных функций белка RB – блокирование деления и направление дифференцировки нейробластов в клетки сетчатки. При мутации в гене RB его белковый продукт со своей задачей не справляется, что и приводит к разного рода опухолям.

Сходную функцию белок RB выполняет и в печени эмбриона, только здесь его мишенью являются эритробласты. Выключение гена RB у мышей приводит к смерти зародышей, поскольку эритробласты теряют способность выделять (энуклеировать) из себя ядра. Мы знаем, что у млекопитающих зрелый эритроцит на самом деле не клетка, поскольку у него нет ядра – это просто цитомы, «набитые» гемоглобином. Энуклеация ядер не происходит, потому что макрофаг теряет контакт с эритробластами и поэтому не может передать им соответствующий сигнал.

Что же это за сигнал? Явароне считает, что это продукт гена Id (Inhibiting domain – ингибирующий домен), кодирующий ядерный белок, который выполняет функцию ТФ. Введение этого белка в клетки с выключенным геном RB восстанавливает их функцию и поддерживает жизнеспособность зародыша. Белок RB стимулирует дифференцировку макрофага, противодействуя ингибирующему действию Id на ген другого ТФ – Рu, главного регулятора развития и дифференцировки макрофага. Нужный эффект достигается просто: RB связывает Id, блокируя действие последнего на Pu.

В итоге стимулируется эритропоэз в печени зародыша. Стоит также подчеркнуть, что гены Id и Pu тоже в результате мутаций могут обрести онкогенный потенциал. Это лишний раз подчеркивает важность фундаментальных исследований генетических процессов в ходе деления и дифференцировки стволовых клеток.

Nature, 2004, № 7020

Табак и спиртное

Марк Твен говорил, что бросить курить очень просто – он сам делал это сотни раз! И действительно есть люди, которые могут «слезть с иглы», бросить пить или курить, однако большинству это не удается.

Всегда встает вопрос: почему одни могут, а другие нет? Вполне возможно, что ответ на него дал Э.Топпер из Калифорнийского технологического института (Калтех) в Пасадене. Его статья в журнале Science, опубликованная в одном из последних номеров за 2004 г., называлась «Никотиновая активация рецепторов ацетилхолина вполне достаточна для возникновения чувства вознаграждения, толерантности и приятного возбуждения». Поясним, о чем идет речь.

Нейроны общаются с внешним миром посредством специфических белков-рецепторов, встроенных, или интегрированных, в их мембраны. Рецепторы связывают молекулы биологически активных веществ, которые не всегда оказывают на организм благоприятное воздействие. К последним относятся, конечно же, такие алкалоиды как никотин табака и множество аналогов опиума, содержащихся в латексе, выделяющемся из поврежденных стенок незрелых коробочек мака. Растения синтезируют эти токсичные для нервной системы вещества, чтобы защитить себя от поедания животными.

В 1990 г. в Science была опубликована статья К.Уоффорда из Колорадского университета (Денвер, США), который вместе со своими коллегами показал, что мыши разных линий с генетически закрепленной продолжительностью сна различаются по чувствительности к действию этанола. Было обнаружено, что продолжительность сна регулируется белковым рецептором гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК). Нервные клетки, которые реагируют на ГАМК и вырабатывают ее сами, относятся к 10% нейронов, тормозящих работу мозга.

Интерес к этим клеткам и их рецепторам был обусловлен тем, что они так же реагируют и на бензодиазепины – лекарства с успокаивающим действием, одним из которых является знаменитый валиум. При возбуждении этих нейронов наш мозг впадает в состояние освежающего сна. ГАМК же активно используется врачами при лечении людей с черепно-мозговыми травмами, чтобы защитить их мозг.

У мышей этанол активировал рецепторы ГАМК только вфазе долгого сна, но никак не влиял на рецепторы в фазе короткого сна. Такое же воздействие этанол оказывал и на рецепторы возбуждающих нейронов. Как писали в заключении свой статьи ученые, «гены, кодирующие рецепторы, могут быть критическими детерминантами индивидуальных различий в чувствительности к этанолу».

Люди тоже по-разному чувствительны к действию этанола: одни впадают в ярость, а другие засыпают. Кстати аналог бензодиазепина, который конкурирует с алкоголем за связывание с рецептором, противодействует спирту и защищает нервные клетки от биохимических и электрофизиологических сдвигов, которые наблюдаются у пьяных, т.е. проявляются в поведении человека. Дальнейшие исследования на генетическом уровне показали, что разница между пьяницами-дебоширами и сонями заключается всего лишь в одной-единственной аминокислоте, которая присутствует в месте связывания ГАМК с ее рецептором.

В упомянутой выше статье Э.Топпера также сообщается о вариации всего в одном аминокислотном остатке в рецепторе ацетилхолина, с которым связано различие в действии никотина.

Ацетилхолин – одно из важнейших возбуждающих веществ в нашей нервной системе. При его выделении, как и при выбросе адреналина надпочечниками, резко повышается тонус мышц и умственное напряжение, что крайне необходимо в экстремальных ситуациях. Поэтому нет ничего удивительного в том, что концентрация ацетилхолиновых рецепторов повышена в так называемых нервно-мышечных соединениях.

Сегодня известно, что у человека имеется не менее дюжины генов ацетилхолиновых рецепторов. В ацетилхолиновом рецепторе есть очень консервативный, т.е. встречающийся почти во всех случаях, остаток лейцина в 247-м положении от начала белковой цепи. Консервативные остатки лейцина свойственны не только никотиновому рецептору, но также и рецептору ГАМК и другим рецепторам. Во всех случаях его замена приводит к резкому повышению возбудимости рецептора.

Ацетилхолиновый рецептор: А – две молекулы ацетилхолина связываются с молекулами белка-рецептора, приводя к открытию ионного канала в мембране; Б – ионный канал закрывается через непродолжительное время; В – ацетилхолин отсоединяется, и рецептор возвращается в первоначальное состояние – канал закрыт

Э.Топпер открыл значительно более специфичную, или «четкую», замену – тоже остатка лейцина, но в 9-м положении, на другую гидрофобную аминокислоту – аланин, в результате которой очень резко повышается способность рецептора ацетилхолина связываться именно с никотином. Это приводит к гиперчувствительности человека к этому алкалоиду, из-за которой возникает такая зависимость от него, что человек не может отказаться от табака.

Сейчас трудно сказать, имела ли эта генетическая вариабельность какое-то значение для первобытного человека или его предков, но это прекрасный пример того, что люди отличаются друг от друга на генетическом уровне. Ещё недавно этот вид изменчивости не привлекал особого внимания ученых, однако последние достижения в геномике позволяют нам по-новому взглянуть на всю историю происхождения человека.