Л. В. Яковенко

Мимивириды – новая ветвь на филогенетическом древе жизни

Сейчас слово «вирус» знакомо практически всем. Однако то, что оно означает, вызывает споры даже у специалистов-вирусологов. Этому в немалой степени способствовали открытия последних лет в области микробиологии.

История вирусов начинается с открытия вируса табачной мозаики Д.И. Ивановским в 1892 г. Через несколько лет были открыты вирусы животных, а затем и бактериофаги. Тогда вирусы считали просто очень мелкими микробами, не способными расти на искусственных питательных средах, а бактериофаги вообще не относили к живым системам, считая их противомикробными агентами вроде ферментов.

Вирусы – субмикроскопические (т.е. не видимые с помощью светового микроскопа) объекты размером обычно 20–200 нм, состоящие из генетического материала (одно- или двухцепочечной ДНК или РНК), окруженного белковым или белково-липидным чехлом, или капсидом. Отдельную вирусную частицу называют вирионом.

К 60-м гг. прошлого века были идентифицированы многие вирусы. Изучение их строения и способов размножения показало, что под принятое тогда определение организма вирусы не попадают, поскольку не обладают собственной системой синтеза белка и способ их размножения также отличается от способов размножения всех других организмов (деление, почкование и т.д.). В журнале Nature в апреле этого года французские микробиологи предложили новый подход к классификации организмов. Авторы считают, что организмы можно разделить на две основные группы: рибосомальные (эукариоты, археи и бактерии) и капсидные (вирусы). Для других самовоспроизводящихся частиц (плазмиды, вироиды и др.) предложено название orphan replicons (репликоны-сироты), для которого пока нет перевода на русский язык. При таком подходе вирусы приобретают законный статус полноценного организма. Изменению точки зрения на место вирусов в живой природе немало способствовали открытия последних лет, о которых речь пойдет ниже.

Вирусы, не имея собственного метаболизма, ведут исключительно паразитический образ жизни, используя в своих целях биохимический аппарат клетки хозяина. Вирионы не способны к активному движению и перемещаются либо с потоками жидкости или газа, либо путем пассивной диффузии. Контакт вируса с клеткой происходит в результате случайной встречи. Для прикрепления к клетке-хозяину и проникновения в нее вирусы используют специфические для данной клетки поверхностные белки, часто белки-переносчики. После проникновения в клетку вирус начинает размножаться.

При размножении вируса вирионы образуются либо полностью самостоятельно путем самосборки из белков и нуклеиновых кислот, синтезированных в разное время и в разных местах, либо с участием клетки-хозяина (некоторые фаги, оболочечные вирусы). Хотя вирион и является индивидуальной вирусной частицей, но на этой стадии вирус не проявляет активной жизнедеятельности – она начинается после разрушения вириона при контакте с клеткой-хозяином.

Среди вирусов есть и неполноценные, или дефектные, виды. Многие онкогенные ретровирусы являются дефектными, т.к. приобретение онкогенов часто сопровождается делециями остальных генов. В присутствии биологически близких полноценных вирусов-помощников дефектный вирус может либо реплицироваться, либо использовать белки вируса-помощника. Очень важно, что дефектные вирусы могут использовать белки и биологически отдаленных видов. Например, дефектный по оболочечным белкам ретровирус, размножаясь в присутствии вируса везикулярного стоматита, заимствует его внешнюю оболочку. Впрочем, при смешанной инфекции несколькими нормальными вирусами часто образуются вирионы с оболочками других вирусов.

Существует несколько групп вирусов, которые всегда дефектны по репликации и являются сателлитами неродственных им полноценных вирусов. Так, аденосателлиты имеют собственный геном и собственные белки и реплицируются в присутствии вирусов-помощников, которыми могут быть не только аденовирусы, но и герпесвирусы. Эти три группы (дефектные вирусы и две группы вирусов-помощников) являются ДНК-содержащими вирусами. РНК-содержащий вирус некроза табака имеет также РНК-содержащий вирус-сателлит, геном которого кодирует собственные белки. Сателлитом ДНК-содержащего вируса гепатита (гепаднавируса) является РНК-содержащий дельта-вирус, реплицирующийся и образующий нуклеокапсиды из собственного белка в присутствии любого гепаднавируса, внешнюю оболочку которого он потом и использует.

Из этих примеров видно, что геномы дефектных вирусов не способны к репликации, поэтому этот процесс обеспечивается вирусами-помощниками. Это своеобразный паразитизм вирусов на вирусах, хотя и «внешний» (до недавнего времени не было известно примеров, когда вирион содержал бы другую вирусную частицу). Отметим, кстати, что дефектные по репликации сателлиты являются наиболее мелкими вирусами. Так, геном дельта-вируса имеет молекулярную массу около 5х10⁴ Да, а единственный его ген кодирует единственный капсидный белок.

Сходными с сателлитами свойствами обладают плазмиды. Это относительно небольшие кольцевые, реже линейные, молекулы ДНК с молекулярной массой обычно менее 10⁷ Да, которые часто обнаруживаются в бактериальных клетках. Плазмиды обычно находятся в свободном виде в цитоплазме, но могут и быть включены в геном клетки-носителя, причем клетка может от них освобождаться. Гены, содержащиеся в плазмидах, могут обеспечивать синтез очень разных по выполняемым фунциям белков: токсинов, убивающих насекомых, факторов опухолевого роста у растений, ферментов, разрушающих или модифицирующих антибиотики, факторов фертильности, индуцирующих половой процесс у бактерий. Однако гены плазмид, в отличие от вирусов (как нормальных, так и дефектных) и сателлитов, никогда не кодируют белки капсидов, в которые упаковываются нуклеиновые кислоты, и репликацию их обеспечивает клетка. Кстати, в клетках дрожжей были обнаружены подобные структуры – двунитевые РНК, названные киллерами, которые кодируют токсины, убивающие дрожжевые клетки, не имеющие киллеров.

Между плазмидами и обычными вирусами нет резких границ. Так, некоторые плазмиды явно являются производными фагов, утратившими большую часть генов и сохранившими лишь некоторые из них. Ряд вирусов, например вирус папилломы коров, могут длительно персистировать, т.е. находиться в неактивном, латентном, состоянии (такое состояние характерно для вирусов эукариот и соответствует лизогении у фагов) в виде плазмид. Также в виде плазмид с полным или частично делетированным геномом могут персистировать вирусы герпеса.

Развитие генной инженерии сделало возможным не только искусственное получение плазмид из вирусной ДНК, но и встройку в плазмиды чужеродных генов и даже искусственное конструирование плазмид из фрагментов клеточной ДНК.

Возбудителями некоторых инфекционных болезней растений являются вироиды – небольшие (молекулярная масса 120–160 кДа) кольцевые суперспирализированные молекулы РНК. Заболевания, вызванные вироидами, в основном напоминают типичные вирусные болезни: заражение происходит при механической передаче вироидов, которые и начинают размножаться в зараженных клетках. Симптомы болезни напоминают течение вирусной инфекции.

Мимивирус: а - мимивирусы внутри амебы; б и в - микрофотографии мимивируса

Период важных открытий в области микробиологии начался, по-видимому, в 1992 г., когда в ходе исследований, проведенных после вспышки пневмонии в Брэдфорде (Великобритания), в амебах (Acanthamoeba polyphaga), обитавших в воде градирни, был обнаружен микроорганизм, схожий с грамположительными кокками (сначала его так и назвали – брэдфордкокк). Однако все попытки выделить из этого организма рибосомальную РНК (16S rRNA) для стандартного анализа окончились неудачей. Лишь в марте 2003 г. в журнале Science была опубликована статья французских вирусологов с описанием этого микроорганизма, который оказался самым большим из известных вирусов. Из-за сходства с бактерией (мимикрии) он был назван мимивирусом (Mimivirus) и как единственный представитель отнесен к классу мимивиридов группы больших ДНК-содержащих нуклео-цитоплазматических вирусов (NCLDV) т.е. вирусов, репликация которых проходит в цитоплазме и ядре клетки-хозяина.

Вирион мимивируса представляет собой характерный для вирусов икосаэдр (правильный 20-гранник, каждая грань которого – правильный треугольник), к которому прикреплены фибриллы длиной 80 нм. Размерами (400 нм) вирион сравним с такими бактериями, как микоплазма и уреаплазма. По первым оценкам геном мимивируса, представляющий собой линейную хромосому – двойную спираль ДНК, содержал 800 тыс. пар оснований (тпо), что больше, чем у упомянутых бактерий (580 и 752 тпо соответственно).

Это стимулировало расшифровку генома вируса-гиганта. В ноябре 2004 г. в журнале Science расшифрованный геном был опубликован. Оказалось, что он содержит 1181,404 тпо и имеет 1262 предполагаемых открытых рамок считывания (ОРС), из которых 10% соответствуют белкам с известными функциями. Через год было установлено, что геном мимивируса содержит 911 генов белков.

Мимивирус по многим свойствам отличается от своих ближайших родственников по группе больших вирусов NCLDV. Самое удивительное – это не размеры генома, а его содержание. Мимивирус содержит стандартный для всех вирусов группы NCLDV (вирусы оспы, иридовирусы, асфарвирусы и фикоднавирусы) набор характеристических генов (core genes – не изменяющиеся или мало меняющиеся гены, характерные для группы геномов). Однако анализ гомологий генов и утраченных факультативных характеристических генов показал, что мимивирус не родствен ни одному из известных семейств группы NCLDV. Скорее всего, он является первым представителем нового семейства вирусов этой группы. Вдобавок ко всему, геном мимивируса содержит гены, до этого никогда не встречавшиеся у вирусов. Так, в нем содержится информация о многих важных компонентах системы синтеза белков.

Важнейшими ферментами, определяющими перевод генетического кода на язык белков, являются аминоацил-тРНК-синтетазы (ааРС). Они выполняют одну и ту же ключевую роль во всех клеточных организмах (и поэтому очень консервативны). Однако даже в самых сложных вирусах, в частности из группы NCLDV, синтетазы не обнаружены.

В прошлом году группа французских микробиологов, исследуя геном мимивируса, пришла к выводу, что этот вирус использует четыре собственные синтетазы, а также полный набор факторов трансляции: инициации, элонгации и терминации. Анализ структуры ферментов показал, что функционально они в целом аналогичны ферментам архей и эукариот, хотя имеют существенные отличия в сайте связывания антикодона и обладают уникальной димерной конформацией. Пока не ясно, зачем вирусу нужны собственные ферменты (и как они взаимодействуют с клеточными ферментами), но в инфицированной амебе используются именно эти синтетазы. Из результатов филогенетического анализа следует, что гены синтетаз мимивирус получил не в результате недавнего горизонтального переноса от клетки-хозяина, что ставит под сомнение гипотезу об эукариотических предках больших ДНК-содержащих вирусов. В геноме мимивируса содержатся также гены шести тРНК, топоизомераз типа I и II, компоненты всех путей восстановления повреждений ДНК, нескольких ферментов синтеза полисахаридов, а также один сегмент, кодирующий интеин.

До недавнего времени вирусы обычно воспринимались как «мешки с генами» – максимально совершенные и примитивные паразиты, несущие минимум генетической информации, необходимой для инфицирования клетки-хозяина и захвата контроля над ее системой синтеза белков. В этом случае оправданна точка зрения на вирусы как на самовоспроизводящиеся молекулы, а не живые организмы. Генеалогия таких систем вряд ли может быть когда-либо установлена.

Филогенетическое древо больших ДНКсодержащих вирусов.
В правом верхнем углу приведены масштабы для сравнения размеров капсидов и геномов;
длины ветвей дерева соответствуют количеству замен в геноме

Вирофаг: а - размножение вирофага (указан стрелками) в вирусной фабрике мимивируса в цитоплазме амебы; б - вирионы вирофага внутри вириона мимивируса; в - типичный дефект развития мимивируса, вызываемый вирофагом

После открытия мимивируса отношение к вирусам в целом изменилось. Так же как ДНК- и РНК-полимеразы, ааРС имеют гомологов во всех группах организмов (эукариот, эубактерий и архей) и поэтому могут быть использованы для уточнения положения организма на древе жизни, в корне которого находится «последний общий предок». По имеющимся данным, мимивирус, видимо, образует вполне независимый четвертый домен жизни – свой собственный. При этом организм, от которого мимивирус унаследовал свои характеристические гены, должен был существовать во время (или ранее) появления первой эукариотической клетки. Это согласуется с высказанной ранее некоторыми вирусологами гипотезой о причастности больших ДНК-содержащих вирусов к возникновению клеточного ядра. Если принять точку зрения на большие ДНК-содержащие вирусы, как на результат редукционной эволюции от общего предка (с учетом горизонтального переноса генов, свойственного паразитическим бактериям), то появляется принципиальная возможность его установления и построения филогенетического древа современных вирусов.

Продолжая изучать мимивирус, французские вирусологи обнаружили в инфицированной амебе и в зрелом вирионе мелкие частицы, оказавшиеся вирионами сателлита мимивируса, который назвали «спутник» (Sputnik). Этот маленький вирус с икосаэдрическим капсидом размером около 50 нм содержит двойную спиральную нить ДНК длиной 18 343 пар оснований. Из предполагаемого 21 гена, кодирующего белок, 8 имеют гомологов, из которых 3 явно получены от мимивируса. Остальные белки родственны белкам вирусов, инфицирующих эукариот, эубактерий и архей, в частности, белкам морских вирусов.

По мнению ученых, спутник является представителем нового неизвестного семейства вирусов. Он не может самостоятельно размножаться в амебе, но в присутствии мимивируса его численность после некоторого скрытого периода быстро нарастает. Для размножения он использует «вирусную фабрику» мимивируса. Такое вмешательство спутника не проходит даром для мимивируса: появляется много неполных вирионов и вирионов с дефектным капсидом. В последнем случае капсид становится асимметричным, и его толщина в некоторых местах может увеличиваться с 40 нм до 240 нм. В целом продукция вирионов мимивируса в присутствии спутника снижается на 70%, а смертность амеб от мимивирусной инфекции снижается втрое.

Учитывая функциональную аналогию спутника с бактериофагами, ученые предлагают классифицировать его как вирофаг. Так же как и бактериофаги, вирофаг может способствовать горизонтальному переносу генов между гигантскими вирусами. Однако пока не установлено, имеет ли спутник стадию профага, когда его геном встраивается в геном вируса-хозяина.

В заключение вернемся к проблеме эволюции вирусов. Положение вирусов на границе между живой и неживой природой приводит к резкому разделению мнений об их эволюции. Если считать вирусы неживыми объектами, то они становятся категорией биологической, но не эволюционной. Если наоборот, то нужно найти им место на общем филогенетическом древе жизни. Мнения о времени возникновения вирусов имеют диапазон от «сначала вирусы, потом клетки» до «сначала клетки, потом вирусы». Очевидно, вирусы – не монофилетическая группа. Никто не сомневается, что, например, маленькие вирусы с геномом в виде однонитевой РНК длиной 5–10 тыс. оснований, такие как вирус табачной мозаики или полиовирус, и большие вирусы с геномом в виде двухнитевой ДНК в 100–500 тпо (герпесвирусы, иридовирусы, вирусы оспы) развивались независимо. Однако сравнительный анализ геномов вирусов из многих групп показывает, что большие и очень неоднородные группы вирусов имеют общее происхождение. Например, вирусы с обратной транскрипцией и мобильные («прыгающие») генетические элементы, несмотря на абсолютно разные жизненные циклы и наборы кодируемых белков имеют, скорее всего, общего предка. Еще больше сюрпризов приносит анализ гомологичных ферментов.

Сразу после открытия мимивируса было показано, что по набору характеристических генов он родствен группе больших вирусов NCLDV. Однако из-за других особенностей его выделили в единственного представителя семейства Mimiviridae. Для установления путей эволюции мимивируса очень важно найти других представителей этого семейства. Акантамеба, организм-хозяин мимивируса, обитает в реках, пресных и соленых озерах, морях, в почве, ее выделяют и из фильтратов атмосферного воздуха. Поэтому мимивирус потенциально может быть обнаружен везде.

Анализ данных из общедоступных библиотек нуклеотидных последовательностей, обнаруживаемых в окружающей среде (так называемые метагеномные данные), показал, что последовательности, сходные с генами мимивируса, содержатся в водах Саргассова моря. Эти результаты были подтверждены анализом самых последних и более полных метагеномных данных, при этом был сделан вывод, что гены, родственные генам мимивируса, попадают в Саргассово море из больших ДНК-содержащих вирусов, инфицирующих фитопланктон. Таким образом, микроводоросли могут быть потенциальным новым хозяином мимивирусов. Так ли это, покажут дальнейшие исследования.

Таблица. Самые большие вирусные геномы в сравнении с самыми маленькими геномами прокариот. На один ген приходится в среднем около 1 тпо