Е. Горячева

Рентгеноструктурный анализ белков

Окончание. См. № 4/2009

При ручном размещении атомов в белковой структуре необходимо учитывать характеристики связей в исследуемой молекуле (длины, углы) и факторы, влияющие на взаимное расположение аминокислотных радикалов (электростатическое притяжение или отталкивание, гидрофобные взаимодействия, водородные связи и др.). Эта работа выполняется с использованием современных мощных графических систем, поддерживающих стереоизображение.

Сложность работы заключается в том, что надо разместить в пространстве тысячи, а то и десятки тысяч атомов. Работа осложняется тем, что, как правило, карты распределения электронной плотности не имеют атомного разрешения, зато облегчается знанием аминокислотной последовательности исследуемого белка, что позволяет строить модель блоками из известных аминокислот. Это очень ответственный этап, т.к. допущенные ошибки исправить потом бывает трудно.

Процедура уточнения – последний этап построения атомной модели исследуемой структуры. Цель этой процедуры – улучшить предварительную атомную модель (созданную на предыдущем этапе) и в результате получить такие координаты атомной модели, для которых рассчитанные модули структурных факторов были бы наиболее близки значениям, полученным в эксперименте.

Математически уточнение представляет собой процедуру минимизации некоторой функции, являющейся мерой близости наборов рассчитанных и наблюдаемых модулей структурных факторов. Для решения этой задачи непосредственного участия исследователя не требуется, все расчеты выполняются с помощью компьютерных программ. Необходимо поместить в программу координаты атомов, полученные на предыдущем этапе в результате ручной подгонки, и набор экспериментальных значений структурных факторов. Затем запускается расчет, который длится от нескольких минут до нескольких часов (в зависимости от сложности структуры и мощности компьютера).

На практике ручное вписывание координат атомов в карту электронной плотности и уточнение полученной модели циклически повторяются.

Такие циклические повторения двух последних этапов рентгеноструктурного анализа осуществляются до тех пор, пока вносимые изменения улучшают структуру (т.е. увеличивается ее соответствие карте электронной плотности, становятся более энергетически выгодными взаимные расположения атомных групп). Обычно на это уходит от нескольких месяцев до года. Если в результате этой работы так и не удается получить удовлетворительной структуры, то приходится признать, что получены неудачные экспериментальные данные или допущены ошибки при их обработке. Однако такие неудачи случаются достаточно редко, и обычно после всех изложенных выше этапов работы мы получаем атомную структуру объекта, которая до этого была не известна. На рис. 7 и 8 изображены структуры, расшифрованные с помощью метода рентгеноструктурного анализа.

Рис. 7. Структура фермента дуоденазы с молекулой субстрата	Рис. 8. Комплекс Fab-фрагмента моноклонального антитела с синтетическим нонапептидом в активном центре

После определения атомной структуры наступает завершающий этап работы, связанный с оформлением полученных результатов в соответствии с определенными стандартами.

Существует специальная база данных, в которой хранятся все расшифрованные на данный момент белковые структуры. Каждой структуре присваивают уникальный идентификационный номер, по которому ее можно быстро найти. Эта база данных носит название PDB (Protein Data Bank – банк белковых структур). Она доступна через Интернет по адресу http://www.rcsb.org. Разумеется, PDB постоянно пополняется. Чтобы поместить в PDB новую расшифрованную структуру, нужно отправить туда не только полученные для нее координаты атомов, но и множество дополнительной информации (параметры кристаллической ячейки, разрешение, при котором проводился эксперимент, полученные для конечной модели значения R-­факторов, сведения об авторах и статьях, в которых опубликованы результаты, и т.д.). В PDB полученную информацию анализируют, и, если возникают какие-­то вопросы, их уточняют по электронной почте. В конечном итоге структура оказывается в базе данных и становится доступной любому исследователю.