Н. Ю. Феоктистова

Нобелевская премия, или Клетки в кармане

В октябре 2007 г. комитет по присуждению Нобелевских премий провозгласил, что награда года по физиологии и медицине присуждена трем ученым – Оливеру Смитису, Марио Капеччи и сэру Мартину Эвансу за открытие «принципов введения специфических генных модификаций в организм мышей посредством эмбриональных стволовых клеток». В чем же суть этого открытия и как пришли к нему его авторы?

Оливер Смитис родился 23 июня 1925 г. в Галифаксе (Великобритания). Образование он получил в Оксфорде, где в 1951 г. защитил докторскую диссертацию по биохимии. В 1953 г. Смитис переехал в Канаду и работал в Университете Торонто, а в 1978 г. перебрался в Университет Северной Каролины, где и занимает сейчас должность профессора патологии и медицины. Оливер Смитис давно уже мог бы получить Нобелевскую премию за изобретение метода разделения биологических макромолекул в электрическом поле – метода гельэлектрофореза. Сейчас в мире нет ни одной лаборатории, которая, работая с биологическими макромолекулами, не использовала бы этот простой и эффективный метод. Но награду Смитис получил за другую работу – открытие возможности коррекции мутировавших генов с помощью механизма гомологичной рекомбинации.

Независимо от Смитиса этой же проблемой занимался Марио Капеччи. Он родился 6 октября 1937 г. в Вероне, после войны переехал в США, где обучался в Гарварде. В 1967 г. Капеччи защитил диссертацию по биофизике, подготовленную под руководством Дж.Уотсона, лауреата Нобелевской премии 1962 г. С 1971 г. Капеччи был доцентом Гарвардской школы медицины, с 1973 г. – профессором биологии Университета штата Юта, а с 1993 г. – почетным профессором факультета генетики человека и биологии того же университета. Начиная с 1980-х гг. ученый работал над получением трансгенных клеток. Он показал, что в клетках млекопитающих с помощью гомологичной рекомбинации можно направленно изменять работу генов.

Если искусственно синтезировать фрагмент ДНК, соответствующий участку одного из генов, изменить его, а потом этот искусственно измененный фрагмент гена внедрить в хромосому, то ген в клетке работать не будет. Это явление получило название «нокаут генов».

Марио Капеччи (слева) и Оливер Смитис (справа)

Итак, Оливер Смитис и Марио Капеччи независимо друг от друга нашли способ выключать те или иные гены в искусственно культивируемых клетках. Но для получения реальных нокаутных организмов необходимы были разработки третьего автора – сэра Мартина Эванса. Он родился 1 января 1941 г. в Глостшире (Великобритания). Учился в Кембридже и в Университетском колледже Лондона, где затем и работал с 1966 по 1974 г. Позже он работал в Кембридже и в Университете Уэльса. В 2004 г. за выдающиеся заслуги перед наукой королева Елизавета посвятила Мартина Эванса в рыцари. Сейчас сэр Мартин возглавляет школу биофизики в Кардиффском университете. Этот ученый работает с эмбриональными стволовыми клетками. Клетки берут на стадии бластоциста (их примерно 50 штук, и они находятся внутри шара бластоциста). В природе такое состояние организма существует очень недолго – всего несколько часов. Так что для ученых очень важно было зафиксировать это состояние и научиться наращивать полученные из бластоциста клетки. Эванс не только научился это делать, но и сумел поместить эти клетки в бластоцист другой мыши так, что они встроились в него и начали развиваться в нормальные ткани и органы мышонка, который затем благополучно появился на свет. Для того чтобы доказать факт встраивания чужеродных клеток в зародыш, Эванс использовал линии мышей различной окраски. Мыши, от которых он получал эмбриональные стволовые клетки, были белыми, а те, в бластоцист которых эти клетки вводили, – черными. На свет рождалось потомство с пятнистой окраской, что и говорило о присутствии в организме клеток двух разных линий мышей.

Мартин Эванс

В 1986 г. Эванс опубликовал сообщение о том, что с помощью эмбриональных стволовых клеток, выращенных in vitro (т.е. в пробирке), можно получать животных с измененным геномом. К этому времени Смитис и Капеччи на своих моделях уже отработали метод генетического нокаута. Оставалось только совместить обе технологии, что и было сделано. Эванс привез свои клетки в Америку фактически контрабандой, в кармане. Ученые начали совместные эксперименты, которые привели к созданию метода направленного изменения генома у мышей.

Награда, полагающаяся нобелевским лауреатам – 1,08 млн евро, – была разделена между авторами открытия. А в названии премированной работы впервые в истории Нобелевских премий прозвучало слово «мышь». Это можно считать признанием заслуг маленького грызуна – незаменимого объекта при проведении многочисленных экспериментов, помогающих искать подходы к решению самых разных человеческих проблем. В частности, с помощью лабораторных мышей ученые изучают около 800 человеческих заболеваний.

Как известно, геном мыши полностью расшифрован и, как геном млекопитающего, достаточно близок к геному человека. А значит, многие генетические проблемы человечества можно изучать на наших маленьких хвостатых собратьях. В 2004 г. начался всемирный проект по определению функций каждого из примерно 25 тыс. генов мыши. Знание последовательности всех присутствующих в геноме генов позволяет нокаутировать любой из них. А нокаутировав – посмотреть, к каким результатам это приведет, и таким образом сделать вывод о роли каждого гена в организме.

С начала 1990-х гг. опубликовано уже более 3200 сообщений о проведении генетических нокаутов у мышей. Конечно, не все они дают представления о функциях гена, но на их основе уже созданы модели многих заболеваний, в том числе раковых, нейродегенеративных и др. Сейчас благодаря методике выделения эмбриональных стволовых клеток функцию гена умеют включать или выключать не только во всем организме, но и в конкретной ткани или группе клеток.

Выведение линии нокаутных по тому или иному гену мышей стоит примерно 15 тыс. долларов. Правительство США выкупило у коммерческих фирм ряд линий нокаутных мышей для их использования исследовательскими лабораториями и выделило 50 млн долларов на создание еще около 5 тыс. линий мышей с инактивированными генами. Учет всех нокаутных линий поручен Джексоновской лаборатории – самой знаменитой лаборатории мира, являющейся поставщиком и «разработчиком» лабораторных мышей чистых генетических линий. Эта организация была создана в 1929 г. профессором К.К. Литлом в небольшом городке Бар Харбор в штате Мэн. Именно Литл в 1909 г. получил первую пару мышей (родоначальников линии) с рецессивными генами, обуславливающими слабо-коричневую окраску. Буквенное обозначение этих генов и легло в основу названия древнейшей линии мышей – dba (с 1950 г. – DBA). Джексоновской лаборатория была названа в честь Роско Б. Джексона – главы компании Хадсон Моторкар, одного из меценатов, профинансировавших ее создание.

В настоящее время бюджет Джексоновской лаборатории составляет 137,4 млн долл. В ней работает около 1300 человек, и ежегодно эта лаборатория продает по всему миру 2,3 млн мышей на сумму около 70 млн долларов. При лаборатории функционирует самый крупный криобанк мышиных генотипов. Поводом к созданию такого банка послужил случившийся в 1947 г. пожар, уничтоживший значительную часть коллекции традиционно разводимых в лаборатории линейных животных.

В криобанке хранятся в замороженном состоянии эмбрионы, сперматозоиды и яйцеклетки генетических линий мышей. Правда, ведущие криобанки в основном хранят именно эмбрионы, так как эмбрион – это уже особь. И хотя эта особь состоит всего из нескольких клеток, у нее уже есть программа развития, закодированная в геноме. Для восстановления линии достаточно трансплантировать размороженные эмбрионы самкам-реципиентам. Большинство экспертов сходятся на том, что для надежной консервации линии требуется 200–500 эмбрионов. Однако, как свидетельствует мировой опыт, генетическую линию удается иногда восстановить даже из 20 эмбрионов. Полтысячи эмбрионов легко упаковываются в объем всего около 0,3 л, тогда как для поддержания линии живых мышей требуется целый виварий. При этом эмбрионы в замороженном состоянии могут храниться десятки лет и сохранять свой геном в «эталонном» виде, в то время как при размножении мышей в их геномах неизбежно возникают и от поколения к поколению накапливаются «неучтенные» мутации.

Британский ученый Д.Уиттингем с коллегами (в 1972 г. именно они открыли способ заморозки эмбрионов мышей) продолжают и сегодня получать мышей с использованием эмбрионов, замороженных «впрок» более 30 лет назад. А когда в 1989 г. в Джексоновской лаборатории случился еще один грандиозный пожар, который унес около полумиллиона мышиных жизней, криобанк просто спас лабораторию от разорения. Ведь некоторые линии мышей существовали лишь в коллекции лаборатории, так что восстановить их можно было только из собственного криобанка.

Пример Джексоновской лаборатории оказался очень привлекательным, и криоархивы были созданы и в других генетических центрах. Сегодня их число приближается к двадцати. Есть криобанки линий мышей и у нас в стране, например в Пущинском научном центре (неподалеку от Москвы), в питомнике лабораторных животных филиала Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова. Совсем недавно в Новосибирском научном центре на базе Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН началось строительство современного вивария для мелких животных с повышенными требованиями к содержанию. В этом виварии будет свой криобанк, предназначенный для создания архива генетических линий крыс и мышей, в том числе нокаутных. Это позволит проводить исследования на нокаутных животных – решать проблемы, связанные с расшифровкой генетических заболеваний, и искать пути их лечения – и в нашей стране.

По материалам: Журнал «Природа», 2008. № 1. С. 78–83 и № 6. С. 73–75.