И. Гутерман

Возрождение запаха

Очень давно, когда я еще жила в Москве, мне часто дарили розы. Их можно было купить даже зимой, в мороз. Продавцы тогда прятали все цветы в стеклянные «аквариумы» и в них жгли для обогрева свечи. Розы были бордовые, на высоких, толстых и очень колючих стеблях. И форма бутона, и цвет – все было прекрасно, и стояли розы в вазе на удивление долго. До полного совершенства им не хватало только одного маленького, но важного штриха – запаха.

Через несколько лет, уже совсем в другой стране, мне вновь пришлось столкнуться с розами. Они предстали передо мной совсем в иной роли – объекта исследования. Я искала работу и пришла в Иерусалимский университет на факультет сельского хозяйства, где мне предложили делать диссертацию на тему «Геномика лепестков роз: идентификация и изучение новых генов, формирующих запах роз». Тема звучала весьма романтично и мне понравилась. Итак, можно ли вернуть розам их нежный аромат?

Что такое цветочный запах?

Большинство растений выделяют вещества, способные воздействовать на рецепторы человека, вызывая определенные обонятельные ощущения. Химическое различие между приятным и неприятным запахом может быть очень незначительным. При этом композиции одних и тех же веществ, взятых в различных концентрациях, могут ассоциироваться с совершенно различными запахами (запахом называют не только обонятельное ощущение, но и композиции пахучих веществ). Вещества, обладающие запахом, являются легколетучими, липофильными, легко диффундируют через клеточную мембрану и испаряются в атмосферу. Известно уже более 1 тыс. летучих веществ (ЛВ), синтезируемых растениями, и это количество увеличивается, поскольку появляются новые, более чувствительные методы анализа ЛВ.

ЛВ синтезируются не только различными частями цветка, но и вегетативными частями растения (листьями, корнями и стеблем). Запахом могут обладать также и плоды растения. Спектр выделяемых веществ изменяется в зависимости от стадии развития, времени суток, а также от воздействий на растение в целом (например, стресс или повреждение).

ЛВ растений относят к группе вторичных метаболитов, названных так потому, что они, в отличие от первичных метаболитов, не являются универсальными веществами, необходимыми для жизнедеятельности всех растений. Вторичные метаболиты служат для привлечения насекомых-опылителей; многие из них синтезируются в ответ на повреждение растения и токсичны для патогенных бактерий, грибов и других вредителей; известны также вещества, которые могут подавлять рост соседних растений. В плодах вторичные метаболиты играют роль консервантов и, кроме того, являются сигналом (вкус, цвет, запах) для животных, употребляющих данные плоды в пищу и осуществляющих таким образом распространение семян. Некоторые специфические вещества синтезируются растениями в ответ на стресс, например в условиях засухи или повышенного содержания в почве солей.

Химический состав запаха

Несмотря на все разнообразие растительных ЛВ, большинство их относится к трем основным группам: терпены, фенилпропаноиды/бензеноиды и производные жирных кислот.

Терпены являются производными изопрена и в зависимости от количества изопреновых звеньев подразделяются на моно-, ди- (гиббереллины), три- (стероиды), сескви- и тетратерпены (каротиноиды). Всего известно более 20 тыс. терпенов, более половины которых обнаружены в растениях. Не все терпены летучи, и в формировании запаха участвуют в основном моно-, ди- и сесквитерпены. Большинство растительных терпенов – вторичные метаболиты, но терпены гиббереллин и абсцизовая кислота – фитогормоны и относятся к первичным метаболитам. Предшественником всех растительных терпенов является изопентенилдифосфат, который синтезируется как в цитоплазме, так и в пластидах.

Фенилпропаноиды (включая и бензеноиды) являются производными аминокислоты фенилаланина. Путь биосинтеза фенилпропаноидов пока не полностью изучен. Ключевым ферментом биосинтеза фенилаланина является фенилаланинаммониумлиаза, а дальнейшие превращения включают в себя реакции гидроксилирования, метилирования и ацетилирования.

Летучие спирты и альдегиды образуются в результате деградации фосфолипидов и жирных кислот под действием липоксигеназ, гидропероксидаз, изомераз и дегидрогеназ.

Как собрать запах?

Для изучения химического состава запаха используются в основном различные хроматографические методы. Особенно часто применяются газовая или жидкостная хроматография в сочетание с масс-спектрометрией.

Уже в Древнем Египте использовали ароматические масляные экстракты, которые изготовляли из различных трав и цветов. (Этот метод прекрасно описан в нашумевшем романе П.Зюскинда «Парфюмер».)

В современном варианте в качестве растворителя используют спирт, хлороформ и некоторые другие органические растворители. Существенным недостатком полученного экстракта является то, что кроме пахучих веществ в него попадают другие соединения, причем в концентрациях, превышающих концентрации ЛВ в десятки, а иногда и сотни раз. Анализ такой смеси хроматографическими методами – задача весьма трудная.

Для изучения запаха больше подходят методы, позволяющие уловить и сконцентрировать именно легколетучие вещества, так называемый «анализ свободного пространства». Так, например, метод твердофазной микроэкстракции (SPME) использует свойство некоторых полимеров поглощать запахи. Тонкий стержень из такого полимерного материала помещают в плотно закрытый сосуд вместе с растением и выдерживают 10–30 мин. Затем стержень вынимают и помещают в инжектор хроматографической колонки, где он нагревается до температуры 200–250 °С. При нагреве адсорбированные полимером молекулы высвобождаются и попадают в колонку, где тем или иным способом подвергаются фракционированию. Метод этот хорош своей высокой чувствительностью, а также быстротой и простотой использования. Однако есть у него и определенные недостатки: из-за избирательности процесса адсорбции нельзя судить о количествах компонентов в анализируемой смеси, кроме того, на полимер могут адсорбироваться и совсем посторонние молекулы, например те, которые находились в помещении, где проводился анализ.

Название другого метода переводится с английского как «ловушка» (trapping). Метод заключается в том, что растение или какую-то его часть помещают в закрытый сосуд, через который с помощью насоса медленно прокачивается воздух. Подача воздуха осуществляется через фильтр. Запах адсорбируется на другом фильтре, который находится на выходе из сосуда. Для сбора запаха используют специальные полимеры. После окончания эксперимента полимер промывают растворителем (например, гексаном) и таким образом получают «экстракт чистого запаха». Этот метод позволяет судить не только о качественном, но и о количественном составе запаха, а также сравнивать состав запахов, выделяемых одним и тем же растением в различные промежутки времени (например, днем и ночью).

На каких растениях изучают запах?

В течение многих лет исследование запаха сводилось в основном к изучению химической структуры пахучих веществ и налаживанию их синтеза в промышленных количествах для применения в косметической и пищевой промышленности. При этом биохимические пути синтеза и механизмы регуляции выделения ЛВ до недавних пор не были обьектом пристального изучения. Возможно, основной причиной такого невнимания было отсутствие методов, позволяющих регистрировать и определять компоненты запаха in vivo. Кроме того, использование с этой целью наиболее популярного модельного растения – резушки Таля (Arabidopsis thaliana), родственника горчицы и капусты, до недавнего времени казалось невозможным.

Для молекулярных биологов арабидопсис представляет собой почти идеальную модель: высокоплодовитое миниатюрное растение с небольшим по размеру геномом (5 хромосом общим размером 125 млн пар оснований) и коротким (около 6 недель от прорастания до зрелого семени) жизненным циклом является удобным для классического мутационного и генетического анализа. Геном резушки был полностью секвенирован еще в 2000 г.

Метод трансформации – внедрение в растение чужеродных генов – для арабидопсиса значительно проще и эффективнее, чем для всех остальных растений. Существует база данных (http://www.arabidopsis.org/), в которой можно найти очень много информации об этом растении, а также заказать семена. К сожалению, запах у арабидопсиса слабый, поэтому только в 2003 г. ученым удалось проанализировать его состав методом твердофазной микроэкстракции и установить, что более 60% выделяемых арабидопсисом летучих веществ относится к группе терпеноидов. Таким образом, многие важные составляющие запахов других растений, а следовательно и гены, регулирующие выработку этих веществ, у арабидопсиса отсутствуют.

При сравнении геномных данных (см. сайт http: //plantta.tigr.org/cgi-bin/plantta_release.pl) становится понятно, что и другие интенсивно изучаемые растения – рис, пшеница, картофель, помидоры, кукуруза – не могут быть хорошими моделями для экспериментов с запахом. Для исследования ЛВ используются менее «популярные», но сильнее пахнущие растения: кларкия Бревери (Clarkia brewer), львиный зев (Antirrhinum majus), садовая петуния (Petunia hybrida), клубника (Fragaria  ananassa).

В последние годы модным стал глобальный подход, позволяющий работать с такими непопулярными (как биомодели) растениями и получивший название OMICS, которое происходит от терминов «геномика» (genomics), «транскриптомика» (transcriptomics), «протеомика» (proteomics) и «метаболомика» (metabolomics). Геномика позволяет изучить геном организма в целом, транскриптомика определяет, какие гены экспрессируются в заданный момент времени, протеомика дает информацию о белках, а метаболомика составляет карты путей метаболизма. Сопоставление этих данных дает возможность идентифицировать новые гены и определить функции уже известных.

Можно ли вернуть улетучившийся запах?

Садовые розы (Rosa hybrida) обладают сильным запахом, химический состав которого включает весь спектр растительных ЛВ: терпены, фенилпропаноиды и производные жирных кислот. Интересно, что большинство роз, предназначенных для срезания, хотя и не увядают долго, не обладают классическим розовым ароматом, которым обладают садовые розы. В процессе селекции наиболее устойчивых сортов куда-то исчез запах!

Казалось бы, вернуть запах не так уж сложно. Найти соответствующий ген, трансформировать его в растение и... К сожалению, все не так просто. Методы трансформации многих «немодельных» растений еще не разработаны, к их числу относятся и розы.

Часто лимитирующим фактором в биосинтезе тех или иных веществ служит малое количество молекул-предшественников, из которых в одну или несколько стадий синтезируется конечный продукт. В таком случае избыточная экспрессия любого гена, участвующего в превращении предшественника в продукт, не приводит к увеличению количества последнего.

Биосинтез каждого компонента запаха – многоступенчатый процесс, осуществляемый различными ферментами. Поэтому внедрения в геном растения одного работающего гена чаще всего недостаточно для изменения запаха в целом. Иногда, даже имея дело с одноступенчатым биохимическим превращением, не удается достичь желаемого эффекта. Например, монотерпен линалол образуется из изопрена под действием фермента линалолмонотерпенсинтазы и является одним из важных компонентов запаха. Внедрение в геном петунии гена линалолмонотерпенсинтазы не привело к изменению содержания линалола, выделяемого растением. Оказалось, что линалол в петунии образуется, но претерпевает реакцию гликозилирования, а гликозилированный линалол не является летучим. В запахе гвоздики, трансформированной тем же геном, количество линалола повысилось и составило 10% от общего количества выделяемых ЛВ. Однако на обонятельном восприятии запаха наличие этого нового компонента никак не отразилось.

То же произошло и с геном сесквитерпенсинтазы гермакрена D, клонированным из роз и трансформированным в петунию. В цветках петунии дикого типа присутствует природный гермакрен D, что подтверждает наличие необходимого субстрата. Однако у трансформированных растений не было обнаружено значимого увеличения концентрации выделяемого гермакрена D. Избыточная экспрессия в петунии другого гена, клонированного из роз, ацетилтрансферазы (фермента, преобразующего спирт в ацетат), позволила изменить содержание ацетатов в запахе трансформированных растений.

Более детальное изучение путей образования компонентов запаха, а также их взаимосвязи с другими биохимическими процессами (первичного и вторичного метаболизма), происходящими в клетках, позволит в будущем направленно воздействовать не только на запах, но и на другие свойства растений. К настоящему моменту большие успехи уже достигнуты в изучении метаболизма терпенов.