Е. Горячева

Рентгеноструктурный анализ белков

В природе встречается примерно 10¹² различных белков, выполняющих самые разнообразные функции. Это и белки-ферменты, катализирующие биохимические процессы в живой клетке; и белки-переносчики, позволяющие другим молекулам проходить через ядерные или клеточные мембраны или перемещаться между клетками всего организма; и иммуноглобулярные белки, отличающиеся высокой специфичностью взаимодействия с антигенами, что приводит к активации сигнальных путей, обеспечивающих иммунный ответ клеток. Это лишь несколько примеров уникальных свойств белковых молекул. По образному выражению Фрэнсиса Крика, белки важны прежде всего потому, что они могут выполнять самые разнообразные функции, причем с необыкновенной легкостью и изяществом.

При всем своем структурном и функциональном многообразии все природные белки построены из 20 аминокислот, соединенных в соответствии с кодом белкового синтеза. В зависимости от последовательности аминокислотных остатков в полипептидной цепи формируется определенная стабильная трехмерная структура белка, определяющая его структурные и функциональные свойства. Например, для каждого фермента характерна вполне определенная конформация активного центра, обеспечивающего специфическое взаимодействие с молекулами субстратов и осуществляющего каталитический акт. Причем для эффективного образования фермент-субстратного комплекса большое значение имеет не только геометрическое соответствие (комплементарность) молекул фермента и субстрата, но и образование водородных связей, электростатические и гидрофобные взаимодействия между атомами активного центра фермента и молекулы субстрата. Таким образом, любая белковая молекула характеризуется уникальностью структуры, которая определяет уникальность ее функции.

Выяснение пространственной организации белков – одно из основных направлений современной биохимии. Во многих случаях знание структуры белка и его комплекса с ингибиторами является решающим фактором при создании лекарственных препаратов.

Одним из важнейших экспериментальных методов, позволяющих с атомарной точностью узнать, что представляет собой трехмерная структура белка, т.е. определить пространственные координаты всех атомов исследуемого объекта, является рентгеноструктурный, или кристаллографический, анализ. Зная положение каждого атома, можно вычислить межатомные расстояния, валентные углы, углы вращения вокруг связей, распределение поверхностного заряда и другие детали молекулярной геометрии. Эти данные нужны химикам, биохимикам и биологам, изучающим зависимости между структурными характеристиками и функциональными свойствами, а также специалистам, занимающимся изучением электронной структуры молекул и молекулярных взаимодействий. Особое место рентгеноструктурного анализа среди других экспериментальных методов отражает тот факт, что с момента открытия рентгеновских лучей в 1901 г. по настоящее время работы в этой области 12 раз отмечались Нобелевскими премиями.

Применение рентгеноструктурного анализа для исследования сложноорганизованных биологических объектов началось после 1953 г., когда сотрудник Кавендишской лаборатории Кембриджского университета Макс Перутц нашел способ определения структуры крупных молекул, таких как миоглобин и гемоглобин. С тех пор рентгеноструктурный анализ молекул белка помогает нам понять химию биологических реакций. На сегодняшний день известны структуры около 15 тыс. белков и их комплексов с биологически важными молекулами.

Рентгеновские лучи являются электромагнитными волнами с длинами в диапазоне 0,01–10 нм. С коротковолновой стороны они соседствуют с -лучами (длины волн менее 0,1 нм), с длинноволновой – с ультрафиолетовыми (длины волн примерно 10–380 нм).

Для проведения рентгеновского эксперимента необходимо монохроматическое рентгеновское излучение (т.е. строго определенной длины волны). Для этой цели используются различные фильтры и монохроматоры.

Обычно, когда человек слышит о рентгеновском исследовании, он вспоминает рентгеновский кабинет в поликлинике. На самом деле рентгеноструктурный анализ не имеет ничего общего с медицинскими исследованиями. Медицинская рентгеноскопия основана на различии в степени поглощения рентгеновских лучей разными тканями, а рентгеновская кристаллография – на рассеянии рентгеновских лучей электронами атомов. Если в медицине мы получаем рентгеновский снимок исследуемого объекта, то в рентгеновской кристаллографии снимки не содержат никакого изображения чего бы то ни было.

Как же ставится рентгеновский эксперимент? Принципиальная схема проста (рис. 1): исследуемый объект помещают в пучок рентгеновских лучей и измеряют интенсивность рассеянного в различных направлениях излучения. Самый простой способ – поместить на пути пучка лучей фотопленку и по степени потемнения пятна после проявления судить об интенсивности рассеяния в этом направлении. Конечно, на сегодняшний день существуют и более совершенные методы, но сейчас это не важно. В данном случае важно то, что мы смотрим не на интенсивность лучей, прошедших сквозь объект, а на интенсивность лучей, возникших там, где их вроде бы и не должно было быть.

Рис. 1. Схема рентгеновского эксперимента

Итак, на входе мы имеем неизвестный объект, на выходе – набор интенсивностей рассеянных в различных направлениях лучей, или дифракционную картину. Теперь необходимо связать полученную в эксперименте информацию с атомной структурой исследуемого объекта. Перечислим основные положения, на которых строится простейшая математическая модель рассеяния рентгеновских лучей:

1) пучок рентгеновских лучей является плоской монохроматической электромагнитной волной;
2) под воздействием этой электромагнитной волны каждый электрон приходит в движение, которое может быть описано уравнениями для свободных зарядов;
3) движущийся электрон является, в свою очередь, источником новой рассеянной сферической электромагнитной волны, распространяющейся во всех направлениях;
4) эти новые волны суммируются и определяют интенсивность излучения в интересующем нас направлении.

Такая модель называется кинематической теорией рассеяния. Ее основной недочет заключается в том, что на электрон действует не только первичный пучок, но и рассеянные волны, и их влияние может изменять характер его движения. Попытка учесть эти поправки делается в более изощренной динамической теории рассеяния, однако для практических приложений более простая кинематическая теория рассеяния оказывается, как правило, вполне достаточной.

Метод рентгеноструктурного анализа основан на дифракции рентгеновских лучей на кристаллической решетке и поэтому применим только к веществам в кристаллическом состоянии. Это связано с тем, что для регистрации дифракционной картины рассеяния необходимо иметь достаточное количество рассеивающих электронов. Но если образец состоит из большого числа произвольно ориентированных идентичных молекул (раствор), то картина рассеяния будет определяться какими-то усредненными по всевозможным ориентациям характеристиками и вряд ли позволит получить детальную информацию об атомной структуре. Другое дело, если большое количество одинаковых молекул ориентированы одинаково. Такую возможность дают нам кристаллические образцы.

Говоря простыми словами (и не вдаваясь в сложные математические формулировки), кристалл – это такой образец исследуемого вещества, в котором много (~10¹²) идентичных молекул находятся в одинаковой ориентации и их центры образуют правильную трехмерную решетку.

Основная особенность структуры каждого кристалла состоит в том, что он построен из регулярно расположенных в пространстве отдельных атомов или групп атомов. Если каждую повторяющуюся структурную единицу заменить точкой, или узлом, то получится трехмерная кристаллическая решетка (рис. 2). Решетку можно представить себе как систему одинаковых параллелепипедов. Каждый такой параллелепипед носит название «элементарная ячейка кристалла» и описывается шестью параметрами: длинами ребер (a, b, c) и углами между ними (, , ).

Рис. 2. Модель кристаллической решетки

Одна из основных претензий к методу рентгеноструктурного анализа с самого начала исследования структур белков – это то, что в жизни белки находятся в растворе, а при исследовании мы их кристаллизуем. Возникает логичный вопрос: не происходит ли принципиальных искажений структуры молекул белка при кристаллизации? Принято считать, что сильных искажений все-таки не происходит. Доводы в пользу такой позиции следующие.

Во-первых, ряд белков сохраняют ферментативную активность и в закристаллизованном состоянии, т.е. структура изменяется не настолько, чтобы белок стал «неработоспособен». Другое соображение: в кристаллах биомакромолекул значительный объем (от 30 до 80%) занимает растворитель, т.е. упаковка молекул белка в кристалле не плотная и вряд ли вызывает существенные искажения. Некоторые искажения в свободных петлях возможны, но структура активного центра сохраняется. Еще одно подтверждение: альтернативное определение структур некоторых белков методом двумерного ядерного магнитного резонанса не дало существенных расхождений со структурами, расшифрованными рентгеновскими методами.

Монохроматическое рентгеновское излучение, проходя через кристалл, рассеивается в основном на электронных оболочках периодически повторяющихся атомов и образует дифракционную картину, или рентгенограмму (рис. 3). Поэтому экспериментальные рентгеновские данные позволяют судить об особенностях расположения электронов в элементарных кристаллических ячейках. Электрон обладает волновыми свойствами, и его положение в пространстве характеризуется не точными координатами, а функцией распределения электронной плотности (r), которая дает среднее по времени число электронов, приходящееся на 1 ³ (кубический ангстрем). На основании этой функции можно судить о расположении атомов в элементарных ячейках, т.к. каждому атому соответствует сгусток электронной плотности определенной величины. Таким образом, при обработке данных рентгеновского эксперимента нужно решить две задачи.

Рис. 3. В дифракционной картине заключена вся информация о структуре белка

1. Из данных рентгенограммы получить карту распределения электронной плотности (r) в кристалле исследуемого объекта. На этом этапе возникает принципиальная трудность (о которой речь пойдет ниже), связанная с невозможностью получить из эксперимента всю информацию, необходимую для восстановления исследуемой структуры. Для получения недостающей части информации используют различные обходные пути. Но универсального пути нет, и в каждом случае исследователь выбирает наиболее подходящий, основываясь на своем опыте и интуиции.

2. На основании карты распределения электронной плотности (r) определить положения атомов в исследуемом объекте. Для решения этой задачи структура многократно подвергается программной обработке и ручной доводке для достижения наилучшего совпадения с электронной плотностью.

Основные этапы определения структуры белка

Выделение, очистка

С этого этапа начинаются практически все экспериментальные исследования белковых структур. Для получения нужного белка используют различные биохимические методы. Последовательность операций по выделению белков обычно сводится к измельчению биологического материала (гомогенизация), извлечению из него белков, а точнее – переводу белков в растворенное состояние (экстракция) и выделению исследуемого белка из смеси других белков, т.е. очистке и получению индивидуального белка. На этом этапе наибольшая сложность заключается в наработке достаточного для эксперимента количества чистого белка.

Кристаллизация

Получение кристаллов, пригодных для рентгеноструктурного анализа, зачастую процесс трудоемкий и далеко не тривиальный, особенно для сложных соединений, таких как белки и нуклеиновые кислоты. Наличие пересыщенного раствора – необходимое условие кристаллизации. Для получения такого раствора используют различные способы. Один из них заключается в постепенном удалении растворителя обычным испарением, что приводит к росту концентрации вещества в растворе, который в какой-то момент становится пересыщенным. Другой способ связан с использованием зависимости растворимости от температуры. Например, если растворимость с увеличением температуры повышается, можно приготовить насыщенный раствор при более высокой температуре, а затем медленно охладить его. Благодаря понижению растворимости в процессе охлаждения получается пересыщенный раствор. Третий способ связан с введением в раствор какого-либо вещества, вызывающего понижение растворимости. В качестве таких веществ используют либо соли, либо органические растворители. Кроме того, растворимость белков и нуклеиновых кислот сильно зависит от pH раствора, это тоже можно использовать для получения пересыщенных растворов.

На практике все намного сложнее. До сих пор не существует универсальных способов подбора оптимальных условий кристаллизации. Для каждого конкретного белка исследователь ищет эти условия, меняя тип буфера, значения pH, температуры, концентрации самого белка, осаждающей соли и т.д. В этой работе важно найти такие условия, при которых получится именно кристалл, а не выпадет соль. Поэтому выращивание биологических кристаллов не только научное направление, но и искусство. Иногда, чтобы заставить белок кристаллизоваться, его центрифугируют или даже отправляют в невесомость.

Выбор кристаллов для рентгеновского эксперимента проводят с помощью микроскопа. Для этой цели особенно полезен поляризационный микроскоп, позволяющий с помощью поляризационного света установить наличие дефектов в кристалле. Оптимальными считаются монокристаллы с размером каждой из сторон 0,2–0,6 мм. Кристаллы должны быть без дефектов и, по возможности, с хорошей огранкой. Наличие дефектов приводит к ошибкам при экспериментальном измерении дифракционной картины и, как следствие, к неточности (а часто и к невозможности) расшифровки кристаллической структуры. При повышении сложности исследуемого объекта требования к качеству кристаллов повышаются. Как выглядят кристаллы белков, показано на рис. 4.

Рис. 4. Кристаллы белков: а – кристаллы зеленого флуоресцентного белка zGFP506; б – кристаллы мутанта белка zGFP506 с аминокислотной заменой N66D

К сожалению, далеко не всегда удается получить кристалл изучаемого белка, поэтому этот этап является главным ограничением метода рентгеноструктурного анализа белков.

Рентгеновский эксперимент, обработка результатов

В качестве источника рентгеновских лучей в настоящее время стараются использовать синхротронный ускоритель. Это довольно дорогое сооружение. Лабораторные рентгеновские установки тоже используются, но синхротронное излучение имеет существенные преимущества.

Во-первых, это мощность пучка. Здесь два плюса. Первый понятен – сокращается время эксперимента. Второй – биологические кристаллы имеют тенденцию разрушаться под действием рентгеновского излучения. Процесс разрушения занимает определенное время, и если пучок мощный, то можно успеть зарегистрировать нужную картину, пока кристалл не разрушился.

Во-вторых, это возможность получить желаемую длину волны. Рентгеновские трубки дают мощный пучок только фиксированной длины волны (обычно около 1,57), в то время как при проведении эксперимента зачастую необходимо иметь возможность выбора длины волны. Это позволяет сделать синхротрон.

Обработка результатов рентгеновского эксперимента базируется на мощном математическом аппарате, который здесь мы рассматривать не будем. Когда монохроматический рентгеновский луч падает на определенным образом ориентированный кристалл, то рассеяние происходит в дискретных направлениях, определяемых кристаллической решеткой. Дифракционная картина, возникающая на пленке детектора (рис. 3), представляет собой набор пятен, или рефлексов. Измерив интенсивность рефлексов, можно получить значения модулей т.н. структурных факторов (комплексных чисел), описывающих распределение электронной плотности в кристалле (r). Но чтобы однозначно определить (r), нужно знать еще и соответствующие значения фаз этих факторов, информация о которых не содержится в дифракционной картине. Если для какого-либо кристалла фазы определены, то расчет положений атомов этого кристалла не составляет принципиальных трудностей.

Таким образом, центральная проблема метода рентгеноструктурного анализа, называемая фазовой проблемой, заключается в невозможности получения всех необходимых для расчета данных непосредственно из эксперимента.

Общего решения фазовой проблемы на сегодня не существует. Каждый случай требует специального подхода. Здесь важно понимать, что новая информация не берется ниоткуда. Для того чтобы получить значения фаз, мы должны либо сделать какие-то новые предположения о структуре и особенностях объекта, либо провести новые эксперименты. Ниже приведены основные подходы к решению «фазовой проблемы», применяемые в белковой кристаллографии.

Изоморфное замещение

Можно попытаться внедрить в молекулы кристалла некую метку – один или несколько тяжелых атомов (например, ионы тяжелых металлов), которые могут быть либо добавлены к нативной структуре, либо могут замещать часть ее атомов (рис. 5).

Рис. 5. Изоморфное замещение белков

Под изоморфным внедрением тяжелых атомов подразумевается, что они присоединяются к каждому экземпляру молекулы в одном и том же месте, и структура молекулы белка при этом не изменяется. Затем, проведя дополнительно рентгеновский эксперимент с таким модифицированным соединением и определив изменения интенсивностей рефлексов по сравнению с нативным белком, можно получить дополнительную информацию о значениях фаз. Трудность этого метода заключается в том, что не всегда удается получить хорошее изоморфное производное, а также в необходимости проведения дополнительного рентгеновского эксперимента.

Метод изоморфного замещения является основным методом решения фазовой проблемы при определении структуры биологических макромолекул. Сам этот метод возник достаточно давно, но именно при работе с белками он приобрел исключительно важную роль. Причин этому две:

1) долгое время он являлся единственным методом, позволяющим решать фазовую проблему для белков;

2) именно для белков удается «достаточно просто» получать изоморфные производные. Последнее связано с тем, что кристаллы белка довольно рыхлые – в них от 30 до 70% объема занято растворителем, т.е. в кристаллах есть «пустоты», куда могут поместиться дополнительные атомы.

Использование эффекта аномального рассеяния

Этот метод основан на варьировании длины волны падающего на кристалл рентгеновского излучения вблизи значений, при которых наблюдается эффект резонанса (и соответствующее аномальное рассеяние) для нескольких «специальных» атомов, содержащихся в структуре макромолекулы. Если аномально рассеивающих атомов в белке нет, иногда можно попытаться присоединить их химическим путем. Дифракционные картины получают для нескольких значений длины волны падающего луча и на основании анализа разностей интенсивностей соответствующих рефлексов оценивают значения фаз.

Успех метода аномального рассеяния, как и изоморфного замещения, во многом зависит от возможности экспериментального получения производных с требуемыми свойствами.

Упомянутые два способа отвечают попытке решить фазовую проблему за счет дополнительной информации, получаемой из дополнительных экспериментов. Следующий способ применяют в ситуации, когда нам известна структура близкого (гомологичного) белка.

Метод молекулярного замещения

В биологии распространена ситуация, когда существуют ряды объектов, похожих друг на друга, т.е. имеющих структурную гомологию. Такой гомологией могут обладать, например, белки одного типа, выделенные из разных организмов. В этом случае можно надеяться, что фазы структурных факторов, рассчитанные по известной атомной модели гомологичного белка, будут достаточно хорошим начальным приближением к значениям неизвестных фаз, отвечающих исследуемому объекту. Комбинируя их далее с измеренными в эксперименте модулями структурных факторов для исследуемого объекта, мы можем получить хорошее приближение к искомому распределению электронной плотности.

Однако для того чтобы надеяться на успех на этом пути, надо, как минимум, для начала «разместить» известный гомологичный объект на том же месте и в той же ориентации, что и исследуемый белок. Процедуру создания такого «компьютерного гибрида», в котором внутри элементарной ячейки кристалла одного белка размещается молекула другого, называют методом молекулярного замещения. Судить о том, насколько полученное размещение близко к действительности, можно, сравнивая рассчитанные по модели модули структурных факторов с величинами, полученными в эксперименте. Разумеется, такое замещение – всего лишь умозрительная процедура, и никакого химического замещения не происходит.

«Прямые» методы

В отличие от предыдущих подходов, эти методы опираются не на дополнительный эксперимент или информацию о структуре гомологичного объекта, а на почти философскую идею об атомности изучаемого объекта. Под «прямыми» методами в кристаллографии понимаются стратегии определения структур, использующие в качестве стартовой информации только набор интенсивностей рефлексов, полученный в рентгеновском эксперименте. Для определения фаз структурных факторов в них используют вероятностный подход. «Прямые» методы более объективны в том смысле, что они зависят только от применения математических соотношений.

На основе «прямых» методов определяют структуры большинства низкомолекулярных соединений. Эти методы не требуют ни дополнительных экспериментов, ни тонкой биохимической работы по получению изоморфных производных, ни наличия известных гомологичных структур, но к сожалению, пока не применимы к структурам белков из-за принципиальных ограничений на количество атомов исследуемой структуры.

Если известны и модуль, и фаза структурных факторов, то мы можем восстановить распределение (r), рассчитав обратное преобразование Фурье. Это не сложная с современной точки зрения вычислительная задача, и этот шаг выделяется потому, что он подводит итог важного этапа работ. Мы, наконец, получаем возможность «взглянуть» на интересующий нас объект. И по тому, насколько «четким» получилось изображение, – судить об успешности всех предыдущих этапов работы. А в случае неудачи – повторить все сначала.

Следующий этап заключается в построении приближенной атомной модели по рассчитанным картам распределения электронной плотности. Эта работа требует максимального использования интеллекта человека и осуществляется квалифицированными специалистами.

С помощью специальных компьютерных программ, исследователь вручную вписывает атомы белковой структуры в полученную на предыдущем этапе карту электронной плотности (рис. 6).

Рис. 6. Модель, вписанная в карту электронной плотности

Продолжение следует