Л. Н. Перова

Биотехнология: от растений до животных и человека

Биотехнология растений

Первым импульсом к генной и хромосомной инженерии послужили достижения клеточной биологии: реализация методов культивирования клеток, тканей и органов. Важным явилось установление принципа тотипотентности – возможности получения полноценного организма из любой клетки на специальных искусственных средах. Вторым импульсом для направленного введения чужих генов в геном другого организма стало изучение болезни растений «корончатые галлы» – появление у поврежденных растений опухолевых образований. Как выяснилось, в геном растений с помощью мегаплазмиды встраивала часть своего генома почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens. Ученые стали заменять опухолеиндуцирующую область плазмиды на искусственно сконструированный вектор, в который включают нужный чужой ген. Бактериями, несущими такую химерную плазмиду, заражают клетки растений и встраивают таким образом нужный ген в их ядерный геном.

Но этот способ эффективен лишь для двудольных растений. Для однодольных используется ДНК-пушка – растительные клетки бомбардируют мельчайшими металлическими шариками, покрытыми ДНК. Попавшая в клетку ДНК встраивается в хромосомы, затем клетка делится, и из нее выращивают целое растение.

Впервые трансгенные растения были получены в 1982 г. в Германии учеными из Кельнского университета совместно с компанией «Monsanto». Растениям тогда придали устойчивость к антибиотику канамицину, ингибирующему рост. За последующие 20 лет в этой компании было создано более 45 тыс. независимых линий трансгенных растений.

Если же говорить о видовом составе, то трансгенные формы были в разное время получены для 120 видов растений. С использованием генной инженерии решаются такие проблемы, как гербицидоустойчивость, устойчивость к насекомым, вирусам, грибковым и бактериальным заболеваниям, повышение общей продуктивности и регуляция сроков созревания. Сегодня среди всех выращиваемых трансгенных растений 71% устойчивы к гербицидам, 22% – к различным вредителям, а 7% устойчивы и к гербицидам, и к вредителям (соя, кукуруза, хлопок, рапс).

Трансгенные растения выращиваются в 11 странах мира – США, Китае, Аргентине, Канаде, Австралии, Мексике, Испании, Франции, ЮАР, Португалии, Румынии. Хорошие перспективы для выращивания трансгенных растений и в нашей стране, где сельское хозяйство приходится вести в сложных климатических условиях, с применением удобрений и пестицидов. Используя меньше химических средств защиты растений, можно будет выращивать безопасные для здоровья продукты.

Выбор за вами!

Во всем мире в средствах массовой информации развернута дискуссия об опасности использования генетически модифицированных организмов – трансгенных растений и животных. По мнению генетика В.К. Шумного, научной основы для такой обеспокоенности нет, ведь организм человека уже давно использует продукты, синтезированные этими генами, в виде пула аминокислот, пептидов и коротких невоспроизводящихся фрагментов нуклеиновых кислот как основу для собственных биосинтетических процессов. В России пока не возделывается ни один вид трансгенных растений, хотя российскими учеными уже созданы трансгенные формы более чем для 20 видов. Использование трансгенных сои, кукурузы, хлопка, рапса, картофеля, томатов, свеклы, тыквы, табака и льна формально разрешено, заканчиваются испытания трансгенного риса и пшеницы.

По мнению профессора А.С. Спирина, проблема трансгенных растений не столько научная, сколько коммерческая. Для человека трансгенные растения по сравнению с обычными опасны не только не более, но скорее даже менее, потому что их качество жестко контролируется. Пока еще нет четких научных обоснований какого-либо влияния генома трансгенного растения на геном человека. Вирусы, встроенные в трансгенные организмы, изначально не инфекционны и не патогенны, они не заражают при контакте и не вызывают симптомов болезней. Гораздо вероятнее возникновение нового патогена из какого-нибудь естественного вируса, что время от времени происходит в ходе эволюции и без вмешательства генной инженерии.

Во всех странах, где выращиваются трансгенные растения, созданы комиссии для их проверки и регистрации. В России этим занимается Межведомственная комиссия по проблемам генно-инженерной деятельности, созданная Правительством РФ в 1997 г. Деятельность в области биотехнологий регулируют более 150 законов, постановлений и нормативных актов.

Испытания на биобезопасность проводят специалисты из Института фитопатологии РАСХН, Института биологической защиты растений РАСХН, Центра биоинженерии РАН. Они изучают участки ДНК, встроенные в геном растения; проверяют, не сможет ли введенный ген переноситься в другие организмы и будет ли передаваться потомкам растения; смотрят, не влияет ли трансгенное растение на почвенную микрофлору и другие составляющие биоценоза.

Санитарно-гигиеническую экспертизу проводят специалисты Института питания РАМН, Университета прикладной биотехнологии и Центра биоинженерии РАН. Они проверяют, одинаков ли химический состав исходных и трансгенных растений; не ухудшается ли биологическая ценность и усваиваемость приготовленных из растений продуктов; не может ли растение и приготовленная из него пища вызывать аллергию или иначе влиять на иммунную систему; не окажутся ли такие продукты токсичными, канцерогенными или мутагенными, не повлияют ли на репродуктивные функции животных и человека.

Наша сегодняшняя пища вообще далека от естественной, в особенности готовые «быстрые продукты». На упаковке такого продукта перечислен целый «букет» добавок и красителей. В США в мясной и молочной промышленности используется огромное количество антибиотиков и гормонов, в частности рекомбинантный гормон роста. К сожалению, этот гормон, полученный путем генной инженерии, имеет побочное действие: вызывает артрит, мастит и другие воспалительные процессы у животных. (Для предотвращения этого приходится существенно увеличивать дозу используемых кормовых антибиотиков.) В Евросоюзе этот гормон считается особенно опасным, и любая продукция, полученная с его помощью, запрещена к импорту.

Больше всего разных токсинов скапливается в ножках кур. Опасными также считаются субпродукты (печень, почки, легкие), мозг и нервная ткань (из-за «коровьего бешенства»). Теперь нужно быть весьма осторожными и с отечественной продукцией, так как производство всяческих добавок, наполнителей и красителей – весьма прибыльный бизнес. И сейчас транснациональные компании (ТНК) видят перед собой огромный рынок – Россию и другие страны. Например, в начале 1990-х гг. пытались «подсадить» наше мясомолочное хозяйство на рекомбинантный гормон роста, ввозя огромное количество доз этого гормона в качестве гуманитарной помощи. Производители и поставщики аспартама проводят различные рекламные акции среди отечественных производителей, убеждая использовать его в производстве вместо сахара, хотя опасность этого вещества известна: оно является нейротоксином, способствует возникновению рака мозга и, может вызывать потерю сознания. Да и по вкусовым качествам аспартам далек от совершенства.

Одной из самых распространенных добавок и наполнителей является соя. Соевый белок добавляют в большое количество мясных изделий. Надпись «растительный белок» на майонезе также обозначает присутствие сои. Лецитин – эмульгатор, добавляемый в шоколад, также получают из сои. Соевый белковый изолят для России – импортный товар.

Политика ТНК не ограничивается желанием только продвинуть свой товар на рынок. Им невыгодно, чтобы в тех или иных странах производилась продукция, свободная от генетически модифицированных организмов: ведь потребитель выберет именно эту продукцию. Европейцы готовы платить втридорога за продукты, свободные от ГМО. Венгрия, например, запретила у себя посадки ГМ-сельхозкультур и сейчас от экспорта своей продукции получает большие прибыли.

Биотехнология животных

Первые опыты на амфибиях

Возможность клонирования эмбрионов позвоночных впервые была показана в начале 1950-х гг. в опытах на амфибиях. Американцы Бриггс и Кинг  микрохирургическим методом (с помощью микропипетки) пересаживали ядра эмбриональных клеток в лишенные ядра (энуклеированные) яйцеклетки. Они установили, что если брать ядра из клеток зародыша на ранней стадии его развития – бластуле, то в 80% случаев зародыш благополучно развивается дальше и превращается в головастика. Если же развитие зародыша, донора ядра, продвинулось на следующую стадию – гаструлу, то лишь в 20% случаев оперированные яйцеклетки развивались нормально.

Английский биолог Гердон первым в опытах со шпорцевыми лягушками (Xenopus laevis) в качестве донора ядер использовал уже вполне специализировавшиеся клетки эпителия кишечника плавающего головастика. Ядра яйцеклеток он разрушал ультрафиолетовыми лучами. Одна десятая часть реконструированных яйцеклеток образовывала эмбрионы, 6,5% из этих эмбрионов достигали стадии бластулы, 2,5% – стадии головастика и 1% – стадии половозрелой особи. Однако в последующих работах результаты этих опытов не подтвердились. Модифицируя эксперимент, Гердон попробовал извлечь из реконструированных яйцеклеток ядра на стадии бластулы и пересадить их в новые яйцеклетки с разрушенными ядрами. Число зародышей с нормальным развитием увеличилось и большая их часть развивались до более поздних стадий. В 1970 г. Гердон и Ласки стали культивировать in vitro клетки почки, легкого и кожи взрослых животных и уже эти клетки использовать в качестве доноров ядер. Теперь 25% реконструированных яйцеклеток развивались до стадии бластулы. При серийных пересадках они развивались до стадии плавающего головастика. Таким образом было показано, что клетки трех разных тканей взрослого земноводного содержат ядра, которые могут обеспечить развитие реконструированной яйцеклетки, по крайней мере, до стадии головастика.

В 1983 г. Ди Берардино и Хофнер использовали для трансплантации ядра неделящихся и полностью дифференцированных клеток крови – эритроцитов лягушки Rana pipiens. В этих опытах 10% реконструированных яйцеклеток достигали стадии плавающего головастика.

Однако взрослые особи у земноводных могут быть получены только в том случае, если донорами ядер будут клетки других зародышей, находящихся на ранних стадиях развития. Дело в том, что в ходе клеточной дифференцировки в процессе онтогенеза в большинстве клеток та часть генома, которая в будущем должна контролировать процесс метаморфоза – превращения головастика во взрослую особь, – необратимо инактивируется.

Неудачи экспериментов с мышами

В конце 1970-х гг. начались опыты на мышах, которые поначалу протекали весьма драматично – зародыши развивались лишь до стадии бластоцисты. В 1977 г. Хоппе и Илменси получили 7 взрослых самок мышей, 5 из которых имели только материнский, а 2 – только отцовский геном. Это зависело от того, какой пронуклеус (ядро яйцеклетки или сперматозоида) был оставлен в оплодотворенном яйце – женский или мужской. Удаляя один пронуклеус, исследователи удваивали число хромосом другого, ^* затем выращивали полученных диплоидных гомозиготных зародышей in vitro (в пробирке) до стадии бластоцисты и пересаживали в матку самки-реципиента для дальнейшего развития. Однако в дальнейшем результаты этих опытов не подтвердились.

В 1983 г. Мак Грат и Солтер усовершенствовали методы извлечения ядер и введения их в клетку. Высокий выход живых мышей они получили, когда в качестве доноров ядер использовали зиготы, а не клетки уже начавших развиваться эмбрионов.

В 1984 г. Манн и Ловел-Бадж выделяли пронуклеусы из яйцеклеток, активированных к партеногенезу, и пересаживали их в зиготы мышей, чьи собственные ядра были разрушены. Эмбрионы погибали на ранних стадиях. Но если пронуклеусы получали из оплодотворенных яиц и пересаживали в партеногенетически активированные и лишенные ядра яйцеклетки, то зародыши развивались нормально до рождения.

В 1984 г. Сурани показал, что нормальное развитие происходит при добавлении мужского пронуклеуса из зиготы мыши к гаплоидному набору хромосом яйцеклетки, а также при рекомбинации мужского и женского пронуклеусов из разных оплодотворенных яйцеклеток мышей.

Таким образом, для нормального развития млекопитающих обязательно требуются и отцовский (мужской), и материнский (женский) геномы – в ходе онтогенеза они проявляют разную активность. В отсутствие одного из них (даже при удвоении второго) развития не происходит – поэтому у млекопитающих нет партеногенеза.

Позднее было установлено, что в эмбриогенезе у мышей клеточные ядра рано теряют тотипотентность, что связано с очень ранней активацией генома зародыша – уже на стадии двух клеток. У других млекопитающих активация первой группы генов в эмбриогенезе происходит на 8–16-клеточной стадии. Поэтому первые значительные успехи в клонировании эмбрионов были достигнуты на других видах млекопитающих, а не на мышах.

Кролики, коровы и свиньи

Среди животных свиньи по ряду биохимических и физиологических показателей наиболее близки к человеку. Клонированные свиньи, выращенные из клеток с введенными в них человеческими генами, могли бы стать ценным источником для трансплантации органов: фирма «Therapeuties» уже разрабатывает соответствующие методики клонирования свиней. Но свиньи являются и переносчиками вирусов от млекопитающих и птиц к людям. В 1998–1999 гг. в Малайзии неизвестный до этого вирус энцефалита Nipath, распространяемый летучими мышами, был перенесен от свиней к человеку. Тогда заразилось 269 человек, 117 из них умерли. Поэтому ни один межвидовой трансплантат не должен быть инфицирован свиными вирусами. Достаточно одной трансплантации, чтобы началась эпидемия.

В 1988 г. американские ученые Стик и Робл, работая по методу Мак Грата и Солтера,  пересадили ядра 8-клеточных эмбрионов одной породы кроликов в 164 лишенные ядра яйцеклетки кроликов другой породы и получили 6 живых животных. Фенотип родившихся полностью соответствовал фенотипу донора.

Работа с реконструированными яйцеклетками крупных домашних животных, коров или овец, происходит немного по-другому. Их сначала культивируют in vivo в перевязанном яйцеводе овцы промежуточного (первого) реципиента. Затем трансплантируют в матку окончательного (второго) реципиента – коровы или овцы, где развитие продолжается до рождения детеныша. Робл пересаживал в зиготы кариопласты – мужские и женские пронуклеусы вместе с цитоплазмой, а также ядра 2-, 4-, или 8-клеточных эмбрионов коровы. Уиладсин в 1989 г. получил четырех генетически идентичных бычков холстейнской породы в результате пересадки в реципиентные яйцеклетки ядер бластомеров одного 32-клеточного зародыша.

Бондиоли, используя в качестве доноров ядер 16–64-клеточные зародыши коров, трансплантировал 463 реконструированных зародыша в матки синхронизированных реципиентов и получил 92 живых теленка (семь из них были генетически идентичны).

Таким образом, было показано, что клеточные ядра зародышей крупного рогатого скота достаточно долго сохраняют тотипотентность и могут обеспечить полное развитие реконструированных яйцеклеток. Методические трудности клонирования зародышей коров практически решены. Но для клонирования взрослых животных остается основная задача: найти во взрослом организме донорские ядра, обладающие тотипотентностью.

В 1989 г. Смит и Уилмут трансплантировали ядра клеток 16-клеточного эмбриона и ранней бластоцисты в лишенные ядра неоплодотворенные яйцеклетки овец. В первом случае было получено два живых ягненка с фенотипом овец – доноров ядер. Во втором случае один ягненок погиб во время родов.

В 1993–1995 гг. Уилмут получил клон овец – пять идентичных животных, донорами ядер для которых стала культура эмбриональных клеток. А в 1997 г., работая с коллегами, Уилмут проверил эффективность использования в качестве донорских ядер эмбриональных клеток, фибробластоподобных клеток плода и клеток молочной железы взрослой овцы, находящейся в последнем триместре беременности. В серии опытов с клетками молочной железы из 277 реконструированных яйцеклеток был получен только один живой ягненок – овца Долли. Анализ генетических маркеров всех 7 родившихся в трех сериях экспериментов живых детенышей показал, что клетки молочной железы были донорами ядер для одного (Долли). В серии с клетками фибробластов плода было получено два и в серии с эмбриональными клетками – четыре ягненка.

Есть ли серьезные основания считать, что реально наступила эра клонирования млекопитающих? У первого успешного эксперимента был существенный недостаток – очень низкий процент выхода живых особей (0,36 %), а также высокая (62%) доля гибели развивающихся реконструированных яйцеклеток в плодный период развития – в 10 раз выше, чем при обычном скрещивании (6%). Встает вопрос о причинах такой высокой гибели зародышей. Все ли пересаженные донорские ядра обладали тотипотентностью? Сохранялся ли полностью их функциональный геном? Это очень важные вопросы, и по одному животному нельзя сделать окончательные выводы.

Теперь главной задачей исследователей, работающих в данной области, стало создание культивируемых in vitro линий малодифференцированных стволовых клеток, характеризующихся высокой скоростью деления. Ядра именно таких клеток должны обеспечить полное и нормальное развитие реконструированных яйцеклеток, формирование не только морфологических признаков, но и нормальных функциональных характеристик клонированного организма.

После публикации работы Уилмута сразу и широко стал обсуждаться вопрос о возможности клонирования человека. Технически клонирование взрослых млекопитающих разработано еще недостаточно. Необходимо расширить круг исследований, включив в него, кроме овец, представителей и других видов животных, чтобы установить, не ограничивается ли возможность клонирования взрослых млекопитающих особенностями или спецификой какого-либо одного или нескольких видов. Необходимо существенно повысить выход жизнеспособных реконструированных эмбрионов и взрослых клонированных особей, выяснить, не влияют ли методические приемы на продолжительность жизни, функциональные характеристики и плодовитость животных. Для клонирования человека очень важно свести к минимуму риск, который в определенной степени все равно останется, – риск дефектного развития реконструированной яйцеклетки, главной причиной которого может быть неполное репрограммирование генома донорского ядра.

По мнению генетика Б.В. Конюхова, когда проблема будет полностью решена методически, человечество признает клонирование как метод помощи бесплодным парам. Хотя клонированный ребенок в биологическом смысле будет однояйцевым близнецом отца или матери. Но тогда тем более требуется заранее решить этические и юридические вопросы, как это было сделано для трансплантации органов во многих странах мира.

Кому нужны люди-клоны?

Нормы биоэтики выдвигаются сейчас на первый план. Те нравственные заповеди, которыми человечество пользуется веками, не предусматривают новых закономерностей и возможностей, какие вносит в жизнь наука. Поэтому людям и необходимо обсуждать и принимать новые законы общежития, учитывающие новые реальности.

Этическая сторона клонирования вызывает много возражений. Во-первых, становление человека как личности базируется не только на биологической наследственности, оно определяется семейной, социальной и культурной средой. При клонировании индивида невозможно воссоздать все те условия воспитания и обучения, которые сформировали личность донора ядра. Во-вторых, при бесполом размножении изначально жесткая запрограммированность генотипа предопределяет меньшее разнообразие взаимодействий развивающегося организма с изменяющимися условиями среды. В-третьих, практически все религиозные учения настаивают, что появление человека на свет – в «руках» высших сил, что зачатие и рождение должно происходить естественным путем.

Новые технологии, без сомнения, приносят пользу человечеству, и их необходимо всячески поощрять. Запреты нужны в тех крайних случаях, когда явно просматривается вред или ущерб для здоровья и благополучия людей. Пока клонирование человека можно отнести к этому разряду: переносить еще не решенную методически научную разработку на человека безнравственно. Эксперименты по кло-
нированию подразумевают участие множества конкретных людей, которые захотят дать свои клетки, и суррогатных матерей, которые должны будут выносить плод. А если так велико количество повреждений эмбрионов и мертворождений, если вообще не ясен конечный результат, этично ли даже говорить о переносе эксперимента на живых людей? Найдутся и безнравственные люди, которые под маркой помощи бесплодным парам начнут выманивать большие деньги, считает Б.В. Конюхов.

По мнению генетика Л.Московкина, клонирование  человека недопустимо – очень велик генетический груз. Фактически становление каждого нового человеческого индивидуума в мире сопряжено с полноценной генетической эволюцией его генетической системы – генетическая информация как бы созревает по жизни, проходя несколько своих метаморфозов со значительными самоорганизованными перестройками в течение внутриутробного развития, при рождении, половом созревании, кризисе середины жизни. Причем путей индивидуальной эволюции несколько – в зависимости от питания, образа жизни, эмоциональной нагрузки, социальной реализованности, комфортности личного жизненного пространства…

Есть и другие возражения. Создание еще одного человека с тем же самым геномом нарушило бы человеческое достоинство и уникальность личности.  Клонирование сократило бы генетическое разнообразие, делая нас более уязвимыми к эпидемиям. Клонирование может привести к созданию людей-монстров или уродов. Из-за несовершенства технологии клонированный организм может оказаться больным. Миллионеры будут клонировать себя только для того, чтобы получить органы для трансплантации.

Но есть и контрдоводы. Сегодня в мире 150 млн естественных идентичных близнецов, чей генетический код не является уникальным. Кроме того, клонирование человека можно производить в очень скромных масштабах. Даже если будет клонирован каждый человек на планете, генетическое разнообразие практически не уменьшится. Клонирование не то же самое, что генная инженерия. При клонировании ДНК копируется, в результате получается близнец существующего индивида. Но ни одна сфера человеческой деятельности не гарантирует полной безопасности. Это относится и к клонированию.  Человеческий клон – человек, и в свободном обществе вы не сможете заставить другого человека дать вам один из своих внутренних органов. 

Юристы призывают к взвешенным оценкам. Р.Свидлер считает, что перед человечеством не стоит угроза неминуемой эпидемии клонирования, генофонд человечества клонирование не истощит, он слишком многообразен, «фермы человеческих органов» никогда не получат легализации. Если появятся клонированные люди, они, как и обычные граждане, будут иметь все конституционные права. Определенные юридические разделы о наследственных, финансовых и других правах придется пересмотреть. Сама процедура клонирования фактически подпадает под определение «биотехнологии», а значит, может быть запатентована, и это – сфера закона об охране интеллектуальной собственности.

Противниками клонирования человека выступают практически все религиозные организации. Ватикан заявил о неприемлемости вмешательства в процессы репродукции и в генетический материал человека и животного. Позиция Русской Православной Церкви пока остается неопределенной. Отец Всеволод считает, что наука должна развиваться, но под контролем общества и государства. При определенных условиях все может быть допустимо – и клонирование животных, и растений, и пересадка органов. Но человеку следует полностью увериться в том, что своими действиями он не навредит ни себе, ни окружающей среде, ни будущим поколениям всего живого.

Наиболее четкое отношение к клонированию человека высказал Совет Европы, принявший Дополнительный протокол к Конвенции «О защите прав и достоинства человека в связи с использованием результатов исследований в биологии и медицине». Протокол запрещает клонирование человеческих существ.

ЛИТЕРАТУРА

Афонькин С.Ю. Против клонирования свиней // Биология. – 2000. – № 17.
Глеба Ю.Ю. Биотехнология растений // Соросовский образовательный журнал. – 1998. – № 6.
ГМ-продукты // Химия и жизнь. – 2002. – № 32.
Дебабов В.Г. Биотехнология: вклад в решение глобальных проблем // Биология в школе. – 1997. – № 1. 
Клонирование человека // Человек. – 1998. – № 3.
Московкин Л. Кому нужны люди-клоны? // Свет: Природа и человек. – 1999. – № 1.
Мякинина Т.М., Капшук Л.Л. Генетически модифицированные продукты: Опасности истинные и мнимые. – М.: Чистые пруды, 2008.
Создание трансгенных растений // Химия и жизнь. – 2000. – № 1.
Шумный В.К. Генная и хромосомная инженерия для растений //Вестник РАН. – 2001. – Т. 71. – № 8.

---

^* Очевидно, что при оставлении ядра сперматозоида развитие могло идти только в том случае, если это оказывалось ядро, содержавшее Х- (а не Y-) хромосому. В этом случае при удвоении генома получались ХХ-особи, т.е. самки. – Прим. ред.